Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

אנו מודים ד רודרר על מתן לנו microdraphs TcdA1. אנו מודים לסטיב לודקה על תמיכתו המתמשכת בתשתית EMAN2. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של החברה מקס פלנק (ל SR) לבין המועצה האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) (מענק מס &#39;615984) (ל SR) ומענק של המכונים הלאומיים של בריאות R01 GM60635 ל PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

חלקיק יחיד cryo-EM הראו התפתחות מהירה בשנים האחרונות ומסירת מבנים ברזולוציה אטומית רבים של קומפלקסים macromolecular של משמעות ביולוגית גדולה 25 . כדי לתמוך במספר גדול של משתמשים מתחילים, כי כרגע הם נכנסים לשדה, פיתחנו את החלקיקים תמונה אחת ניתוח פלטפורמת SPHIRE ולהציג כאן פרוטוקול דרך לאורך כל העבודה כולל יישור הסרט, בחירת החלקיקים, הערכה CTF, המודל הראשוני חישוב, 2D ו 3D ניתוח הטרוגניות, ברזולוציה גבוהה 3D חידוד ואומדן ברזולוציה המקומית וסינון. הפרוטוקול המתואר כאן נועד כמדריך קצר לקביעת מבנה 3D באמצעות microoraphs cryo-EM של החלבון של עניין ועם עזרה של כלי חישוב הניתנים על ידי GUI עצמאית של SPHIRE. התכונה העיקרית של זרימת העבודה היא כי ביותרשל נהלים צריך להיות מופעל רק פעם אחת, שכן הם מסתמכים על הרעיון של אימות על ידי reproducibility 19 ו אינם דורשים פרמטר tweaking. מנגנון אימות אוטומטי זה הוא היתרון העיקרי של SPHIRE על גבי חבילות תוכנה אחרות מאז התוצאות נוטות להיות אובייקטיביות כמו גם לשחזור, והכי חשוב, להשגה במחיר חישוב מקובל. צינור מספק בנוסף שפע של מידע אבחון עבור משתמשים מנוסים לבצע אימות עצמאית נוספת עם שיטות משלו. עם זאת, משתמש טירון שיש לו לפחות רקע תיאורטי בסיסי ביולוגיה מבנית ומיקרוסקופ אלקטרונים אמור להיות מסוגל לקבל מבנים ברזולוציה אטומית כמעט באמצעות נתונים משלו ואת הליכי אימות אוטומטיים. עם זאת, קבלת מבנה ברזולוציה אטומית כמעט לא תמיד פשוטה והתוצאה תהיה תלויה מאוד באיכות המדגם ואת קלט datא. עבור הנהלים המוצגים כאן, ההנחה היא כי כמות מספקת של סרטים באיכות גבוהה גלם לא משויך EM זמינים, עם ממוצעים שלהם מראה בבירור חלקיקים הומוגניים יחיד מכוונת אקראית. באופן כללי, אין מגבלות לגבי הסימטריה, הגודל או הצורה הכוללת של המולקולה, אך משקל מולקולרי נמוך יכול להיות גורם מגביל, במיוחד כאשר לחלבון יש צורה גלובלית חסרת תכונות. בדרך כלל, ניתוח של חלקיקים גדולים, מסודרים היטב עם סימטריה קבוצתית גבוהה הוא פחות תובעני. לכן, זה מאוד ממליץ למשתמשים מתחילים להפעיל את הפרוטוקול הנוכחי הראשון עם מאופיין היטב cryo-EM dataset. או את הנתונים SPHIRE הדרכה (http: /sphire.mpg.de) או אחד הנתונים EMPIAR שהוגשו (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) עם סרטים גולמיים הם נקודת התחלה טובה . כאשר עיבוד הנתונים עצמו, סביר מאוד כי כמה מערכי נתונים או חלק מהתמונות לא יספק quali מסוימיםקריטריונים. בהקשר זה, בנוסף בדיקות אוטומטיות יציבות לשחזור, המבוצעת על ידי התוכנית בשלבים העיקריים של זרימת העבודה, הוא עדיין ממליץ למשתמשים לבחון ויזואלית את התוצאות &quot;מחסומים&quot; מסוימים של הפרוטוקול, במיוחד אם השחזור הסופי אינו מספק. הבדיקה החזותית הראשונה יכולה להתבצע ברמת המיקרוגרף לאחר יישור הסרט ( שלב 2 בפרוטוקול) והערכת ה- CTF ( שלב 3 של הפרוטוקול). ממוצעים המתקבלים בתנועה, צריכים להראות בבירור חלקיקים בודדים המופרדים היטב, וספקטרום הכוח שלהם צריך להראות בבירור את הטבעות האיזוטרופיות. התדר המרחבי אליו הם נראים מגדיר, ברוב המקרים, את הרזולוציה הגבוהה ביותר שעליה ניתן לקבוע את המבנה באופן עקרוני בסופו של דבר. דוגמאות לממוצע מתוקן בתנועה של איכות מספקת וספקטרום הכוח שלה מוצגים בסעיף &amp; #34. תוצאות נציג &quot;.תמונות חריגות יותר אשר עשויה להיות השפעה שלילית על התוצאה הסופית ניתן להסיר בעזרת ספייר של להיסחף ו- CTF הערכה GUI כלים (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). לגבי ההקרנה החלקיקים, השלב המכריע בצינור SPHIRE הוא סיווג 2D באמצעות ISAC ( שלב 5.2 פרוטוקול) . כאן, המשתמש צריך לשלוט כי ממוצעים בכיתה 2 לשחזור מזוהות באופן אוטומטי על ידי התוכנית לאמץ מגוון של אוריינטציות מספיק כדי באופן שווה באופן שווה לכסות את המרחב הזוויתי. אם איכות ממוצעי הכיתה אינה משביעת רצון (תמונות רועשות ו / או מטושטשות) ו / או מספר ממוצעים בכיתה לשחזור הוא נמוך מאוד, שקול לשפר את איכות לקטוף אוטומטי, אופטימיזציה הדמיה dataset או הכנת המדגם. ברוב המקרים, לא ניתן לחשב שחזור אמין ממערכת נתונים שאינה מניבה ממוצעים מעמדיים דו-ממדיים טובים. דוגמאות של איכות גבוהה בכיתה 2 aveזעזועים מוצגים בסעיף &quot;תוצאות נציג&quot;. לפחות 100 ממוצעים מחלקה נדרשים כדי לקבל מודל תלת-ממד אמין ראשוני באמצעות RVIPER באופן אוטומטי ( שלב שלב 6.1 ). בשלב זה, המשתמש צריך לבחור את הממוצעים עם האיכות הגבוהה ביותר וכוללים כמו אוריינטציות שונות של החלקיקים ככל האפשר. איכות המודל הראשוני הוא קריטי להצלחתו של חידוד 3D ברזולוציה גבוהה. בחבילות תוכנה אחרות, סיווג 3D מבוצע לעתים כדי להסיר &quot;רע&quot; חלקיקים 8 , 9 . עם זאת, ב SPHIRE רוב החלקיקים האלה בוטלו באופן אוטומטי כבר במהלך סיווג 2D באמצעות ISAC. לכן, מומלץ לבצע את שלב אינטנסיבית חישובית של מיון 3D רק אם השחזור ואת ניתוח השתנות 3D מצביעים על הטרוגניות של הנתונים. והכי חשוב, המשתמש צריך תמיד לבדוק בקפידה את הכרכים 3D שהתקבלו בזהירות ( שלב שלב 9.3 ), ולאשר כי התכונות של צפיפות בהתאמה מסכימים היטב עם ההחלטה הנומינלית. ברזולוציה של &lt;9 Å, צפיפות דמוית מוט המקביל ל α-סלסלות להיות גלוי. ברזולוציה &lt;4.5 Å, צפיפות המקביל לגדילים ב β- גיליונות מופרדים בדרך כלל היטב חומצות אמינו מגושם להיות גלוי. מפה ברזולוציה גבוהה (&lt;3 Å) צריכה להראות שרשראות צד ברורות, ובכך לאפשר בניית מודל אטומי מדויק. תוצאות שהתקבלו עד כה להוכיח כי, בעזרת מבחני שחזור אוטומטי של SPHIRE בדיקות ויזואליות מינימלי, הפרוטוקול הנוכחי הוא ישים בדרך כלל לכל סוג של פרוייקט יחיד cryo-EM חלקיק. תוצאות נציג של כל שלב עיבוד מוצגים עבור שחזור של רעלן TCDA1 שלPhotorhabdus luminescens 21 , אשר נפתרה ברזולוציה אטומית כמעט. מפות צפיפות של איכות דומה ניתן להשתמש כדי לבנות מודלים אטומיים אמין על ידי השד נובו דה novo כמו גם עידון הדדי או שטח אמיתי, ובכך לספק מסגרת מבנית מוצק להבנת מנגנונים מולקולריים מורכבים. קודי גישה: הקואורדינטות עבור המבנה EM ואת הסרטים unprocessed הופקדו אלקטרונים מיקרוסקופית נתונים הבנק ואת מיקרוסקופית אלקטרונים פיילוט תמונה ארכיון תחת מספרי ההצטרפות EMD-3645 ו EMPIAR-10089, בהתאמה.

לאחר הפיתוח של טכנולוגיית גלאי האלקטרונים הישירה, ההתקדמות המדהימה של חלקיק יחיד cryo-EM כרגע עיצוב מחדש ביולוגיה מבנית 1 . לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, טכניקה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר חלבון ללא צורך התגבשות, בעת ובעונה אחת מציב פחות מגבלות לגבי טוהר המדגם ועדיין המאפשר קביעת מבנים ברזולוציה אטומית כמעט. חשוב לציין, קומפוזיציות או מדינות שונות יכולות כעת להיות מופרדות באופן חישובי וקביעת המבנה של הקונפורמיות השונות יכולה להתבצע ברמה חסרת תקדים של פירוט. לאחרונה, מפות צפיפות של מולקולות מאתגרות יכול להיות מיוצר על החלטות המאפשר בניית מודל novo ובכך הבנה עמוקה של מצב הפעולה שלהם 2 , 3 , 4 , 5. מגוון רחב של עיבוד תמונה חבילות תוכנה זמינים 3DEM (3D אלקטרונים מיקרוסקופיה) הקהילה (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ורובם נמצאים תחת פיתוח מתמשך. רזולוציה כמעט אטומית הושגה עבור חלבונים המציגים משקולות מולקולריות שונות וסימטריות עם מספר חבילות תוכנה שונות, כולל EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ו- SPARX 11 . כל חבילה דורשת רמה אחרת של מומחיות המשתמש ומספקת רמה אחרת של הדרכה למשתמש, אוטומציה והרחבה. יתר על כן, בעוד כמה תוכניות לספק סביבות מלאות כדי להקל על כל השלבים של ניתוח התמונה, אחרים נועדו לייעל משימות ספציפיות, כגון חידוד של פרמטרים יישור החל מ r ידועמבנה האספקה. לאחרונה, פותחו מספר פלטפורמות, כולל APPION 12 ו- SCIPION 13 , המספקות צינור עיבוד יחיד המשלב גישות ופרוטוקולים מחבילות התוכנה השונות המפורטות לעיל. כדי לתרום לפיתוח הנוכחי של cryo-EM, SPARX פותחה מחדש לתוך פלטפורמת עצמאית חדשה מלאה עבור ניתוח חלקיקים בודדים, הנקראת SPHIRE (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה). על מנת להגביר את הנגישות של הטכניקה לחוקרים חדשים בתחום ולהתמודד עם כמות גדולה של נתונים המיוצרים על ידי מיקרוסקופים אלקטרונים מודרניים לחלוטין אוטומטיים מתקדמים, צינור העיבוד עוצב מחדש ופשוט על ידי הצגת קל לשימוש ממשק משתמש גרפי (GUI) ואוטומציה של השלבים העיקריים של זרימת העבודה. יתר על כן, אלגוריתמים חדשים נוספו כדי לאפשר מהיר, לשחזור אוטומטי קביעת מבנה מ crYo-EM תמונות. יתר על כן, אימות על ידי reproducibility הוכנס על מנת למנוע artifacts משותף המיוצר במהלך חידוד וניתוח הטרוגניות. למרות שהתוכנית השתנתה במידה ניכרת, תכונות הליבה המוערכות שלה נשמרו: קוד פתוח של קוד פתוח, עיצוב מודרני מונחה עצמים וממשקי Python עבור כל הפונקציות הבסיסיות. לכן, זה לא השתנה לתוך תוכנית קופסה שחורה, המאפשר למשתמשים ללמוד בקלות לשנות את קוד Python, כדי ליצור יישומים נוספים או לשנות את זרימת העבודה הכוללת. זה שימושי במיוחד עבור פרויקטים שאינם סטנדרטיים cryo-EM. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת מפת אטומי ברזולוציה אטומית כמעט מ cryo-EM תמונות באמצעות GUI של SPHIRE. הוא מתאר בפירוט את כל השלבים הנדרשים כדי ליצור מפה צפיפות מ cryo-EM ישיר גלאי סרטים אינו מוגבל לכל סוג מקרומולקולה מסוים. פרוטוקול זה בעיקר מתכוונת להדריך newcOmers בתחום באמצעות זרימת עבודה ולספק מידע חשוב על צעדים מכריעים של העיבוד, כמו גם כמה מכשולים אפשריים ומכשולים. תכונות מתקדמות יותר ואת הרקע התיאורטי מאחורי SPHIRE יתוארו במקומות אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIX (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה) הוא קוד פתוח חדש, חבילת תוכנה ידידותית למשתמש לעיבוד אוטומטי למחצה של חלקיקים בודדים של קריאת מיקרוסקופ אלקטרונים (cryo-EM). הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בפירוט כיצד להשיג מבנה אטומי ברזולוציה כמעט החל cryo-EM סרטים micrograph ידי הדרכת משתמשים בכל השלבים של צינור יחיד קביעת מבנה החלקיקים. צעדים אלה נשלטים מממשק המשתמש הגרפי החדש של SPHIRE ודורשים התערבות משתמש מינימלית. באמצעות פרוטוקול זה, מבנה 3.5 Å של TcdA1, מורכב רעלן Tc מ luminescens Photorhabdus , נגזר רק 9500 חלקיקים בודדים. גישה זו יעילה יעזור למשתמשים טירון ללא ניסיון עיבוד נרחב מידע מבניים מראש , כדי להשיג מודלים ללא אטום ללא רעש וללא משוא פנים של קומפלקסים macromolecular מטוהרים שלהם במדינה יליד.

<html> הפרוטוקול המתואר לעיל בוצע החל 112 סרטים גלאי ישיר של רכיב A של Photorhabdus luminescens Tc מורכבות (TcdA1) 20 , 21 , 22 . מערך נתונים זה הוקלט על מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים בעל שדה בהירות גבוהה (XFEG), הפועל במתח תאוצה של 300 קילו וולט. התמונות נרכשו באופן אוטומטי עם מינון כולל של 60 e - / Å -2 בגודל פיקסל של 1.14 Å על סולם הדגימה. לאחר היישור של מסגרות הסרט ( שלב 2 פרוטוקול ), המתקבל תיקון ממוצעים שהתקבלו היו טבעות איסוטרופי Thon מרחיב ברזולוציה גבוהה ( איור 2 א ). חלקיקים בודדים היו גלויים בקלות מופרדים היטב ( איור 2 ב ). חלקיקים נבחרו מכן באמצעות כלי נחיל של e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( פרוטוקול שלב 4.1 ). במקרה זה, סף מתאים נקבע באמצעות אפשרות סלקטיבית יותר ( איור 2 ג ). 112 המיקרוגרפים הדיגיטליים הניבו 9,652 חלקיקים. רוב התמונות שחולצו ( פרוטוקול שלב 4.2 ) הכיל חלקיקים מוגדרים היטב גודל התיבה שלהם היה פי 1.5 יותר מאשר גודל החלקיקים, כפי שהומלץ ( איור 2 ד ). לאחר מכן, באמצעות ISAC, בוצע ניתוח הטרוגניות דו-צדדית ( פרוטוקול שלב 5 ). זה הניב 98 ממוצעים בכיתה ( איור 3 א ). באמצעות ממוצעים אלה ברמה 2 ד, מודל AB initio חושבה באמצעות ויפר ( פרוטוקול שלב 6 ) ברזולוציה ביניים ( איור 3 ב ). מודל זה מראה הסכם מצוין עם המבנה הגבישי של TcdA1 בעבר נפתרה ב 3.9 Å ברזולוציה 22 ( איור 3 ג ). מודל זה שימש לראשונה כטבלה ראשונית<html> צלחת עבור חידוד 3D (MERIDIEN), מניב 3.5 Å (0.143 קריטריון) שחזור ( פרוטוקול שלב 7 ) מ ~ רק 40,000 יחידות אסימטריות ( איור 4 ). זה כמעט אטומי מפת הפתרון התקבלה בתוך 24 שעות, באמצעות עד 96 CPUs עבור השלבים של זרימת עבודה כי נהנים ליבות מרובות. עבור ניתוח השתנות 3D (שלב 8 פרוטוקול), רק 2,000 תמונות חלקיקים לכל קבוצה שימשו בשלב 8.3.3 ( כלומר התהליך מתחיל עם 5 קבוצות 3D הראשונית) ו 200 תמונות עבור גודל הקבוצה הקטן ביותר בשלב 8.3.4 עקב את מספר קטן של חלקיקים (~ 10,000). הניתוח חשף גמישות מקומית בעיקר באזור N- מסוף של המתחם המכיל את התג שלו המשמש לטיהור ( איור 5 א ). ואכן, שנים עשר N- מסוף שאריות ואת התג שלו לא נפתרו במבנה גביש שפורסם בעבר של TcdA1&quot;22&gt; ו אזור זה כנראה לא היה פתור עדיין לא פתור את הצפיפות הנוכחית cryo-EM, ככל הנראה בשל הגמישות שלה.שונות נוספת זוהה על תחומים קולטן מחייב את תחום BC- מחייב ( איור 5 א ). פתרון הולם של המבנה וגודל קטן למדי של מערך הנתונים, הוחלט על הטרוגניות זו להיות נסבלת ולפיכך לא בוצע סיווג תלת-ממדי ממוקד 23. לבסוף, החישוב המקומי של מפת הצפיפות הסופית חושב ( פרוטוקול שלב 9.1, איור 5b ) ואת מפת 3D חידד היה מסונן באופן מקומי ( שלב שלב 9.2) . נפח של איכות זו ניתן להשתמש לבניית מודל novo באמצעות Coot 24 או כל כלי חידוד אחרים ( איור 6 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; איור 1: עיבוד תמונה באמצעות SPHIRE. ( א ) GUI של חבילת התוכנה SPHIRE. שלב ספציפי של זרימת העבודה יכול להיות מופעל על ידי בחירת pictogram בהתאמה בצד שמאל של GUI (&quot;שלב זרימת העבודה&quot;). הפקודות והשירותים הקשורים לשלב זה של זרימת העבודה יופיעו באזור המרכזי של הממשק הגרפי. לאחר בחירת אחת הפקודות, הפרמטרים המתאימים מוצגים באזור הימני של הממשק הגרפי. פרמטרים מתקדמים בדרך כלל אינם דורשים שינוי של ערכי ברירת המחדל שהוגדרו מראש. ( ב ) שלבי זרימת עבודה של עיבוד תמונה אחת החלקיקים באמצעות GUI SPHIRE. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> איור 2: Motion תיקון וחלקLe חילוץ. ( A , ב ) אופייני באיכות גבוהה, נמוך במינון, להיסחף תיקון מיקרוסקופ דיגיטלי מוקלט ב defocus של 1.7 מיקרומטר. הערה הטבעות איזוטרופי Thon הארכת ברזולוציה של 2.7 Å בספקטרום כוח (א) ואת חלקיקי להבחין היטב בתמונה 2D ( ב ). ( ג ) בחירת החלקיקים באמצעות e2boxer. עיגולים ירוקים מצביעים על חלקיקים נבחרים. ( ד ) חלקיקים גולמיים אופייניים המופקים מן המיקרוגרף המשוקלל במינון. סולם ברים = 20 ננומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> איור 3: אשכולות דו-ממדיים ודגמים ראשוניים. ( א ) גלריה של ממוצעים מעמדיים דו-מימדיים, כאשר הרוב מייצג צדדים צדדיים<html> F החלקיק. סולם בר = 20 ננומטר. ( ב ) AB תחילת 3D המפה של TcdA1 שהושג באמצעות RVIPER ממוצעים בכיתה ללא התייחסות. ( ג ) התאמת גוף קשיח של מבנה גבישי TCDA1 (סרטים) (pdb-id 1VW1) לצפיפות הקריאו-EM הראשונית (אפור שקוף). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> איור 4: Cryo-EM 3D מבנה TcdA1. ( א , ב ) סופי 3.5 Å צפיפות המפה של TcdA1 מחושב באמצעות ~ 9,500 תמונות החלקיקים: ( א ) צד ו ( ב ) תצוגה העליון. ( ג ) אזורים מייצגים של צפיפות cryo-EM עבור סליל α ו- β גיליון.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח משתנות ורזולוציה מקומית. ( א ) פני השטח של מפת ה- cryo-EM המחודדת של TcdA1 (אפור) ומפת השתנות (ירוק). לקבלת הבהירות טוב יותר, את המפה השתנות היה נמוך לעבור מסונן עד 30 Å. ( ב ) טיוח פני השטח של TCPA1 חידד cryo-EM מפת צבעוני על פי ההחלטה המקומית (Å). שים לב להסכם הטופולוגי בין אזורים בעלי שונות גבוהה ורזולוציה מקומית נמוכה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> איור 6: מודול תלת ממדיאל TCDA1 באמצעות Cot. אזורים נציג של cryo-EM צפיפות המודל האטומי מוצגים עבור סליל α. המודל האטומי נבנה בנובו באמצעות Cot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...