Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
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私たちはTcdA1顕微鏡写真を提供してくれたD. Rodererに感謝します。 EMAN2インフラストラクチャの継続的なサポートに感謝します。この作業は、Max Planck Society（SR）と欧州連合（EU）の第七フレームワークプログラム（FP7 / 2007-2013）（付与番号615984）（SRへ）からの資金と、健康R01 GM60635からPAPへ）。

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

単粒子低温EMは、近年急速な発展を示し、主要な生物学的意義25の高分子複合体の多数の原子分解構造を送達した25 。現在フィールドに入っている多数の初心者ユーザをサポートするために、我々は単粒子画像解析プラットフォームSPHIREを開発し 、ムービーアライメント、パーティクルピッキング、CTF推定、初期モデル計算、2Dおよび3D異質性解析、高解像度3D精緻化および局所分解能推定およびフィルタリングを含む。 本明細書に記載されたプロトコールは、目的のタンパク質の低温EM顕微鏡写真を用いた3D構造決定、およびSPHIREの独立型GUIによって提供される計算ツールの助けを借りて、3D構造決定の短いガイドとして意図されている。 ワークフローの主な特徴は、再現性による検証の概念に依拠しており、パラメータ調整を必要としないため、手順のうちの1回だけを実行する必要があります。この自動検証メカニズムは、他のソフトウェアパッケージと比較してSPHIREの主な利点です。結果は客観的で再現性があり、最も重要なのは受け入れ可能な計算コストで得られる傾向があるからです。パイプラインは、経験豊富なユーザーが独自の方法でさらに独立した検証と評価を行うための豊富な診断情報を提供します。それにもかかわらず、構造生物学および電子顕微鏡法において少なくとも基本的な理論的背景を有する初心者ユーザは、それ自身のデータおよび自動化された検証手順を用いて原子に近い分解能構造を得ることができるはずである。 しかしながら、原子に近い分解能構造を得ることは、必ずしも直接的なものではなく、その結果は、サンプルの品質および入力データに大きく依存するa。ここに提示されている手順では、十分な数の高品質のアライメントされていない生のEMムービーが利用可能であり、それらの平均が明確に識別可能な均質で無作為に配向された単一粒子を示すと仮定する。一般に、分子の対称性、サイズまたは全体的な形状に関する制限はないが、特にタンパク質が特徴のない球状を有する場合、低分子量が制限因子であり得る。通常、高い点群対称性を有する、より大きく、規則正しい粒子の分析は、それほど厳しいものではありません。したがって、初心者ユーザは、まず特性の良い低温EMデータセットで本プロトコルを実行することを強くお勧めします。 SPHIREチュートリアルデータ（http：/sphire.mpg.de）またはEMPIARサブミットデータセット（https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/）のいずれかをRawムービーと一緒に使用することをお勧めします。 独自のデータを処理する場合、一部のデータセットまたは一部の画像が特定の品質を満たさない可能性が非常に高い基準。この文脈では、ワークフローの主要なステップのためにプログラムによって実行される自動化された安定性および再現性チェックに加えて、ユーザがプロトコルの特定の「チェックポイント」で結果を視覚的に検査することは依然として推奨されており、満足できるものではない。 最初の目視検査は、映画整列（ プロトコルステップ2 ）およびCTF推定（ プロトコルステップ3 ）後の顕微鏡写真レベルで行うことができる。得られたモーション補正された平均値は、はっきりと識別され、よく分離された単一粒子を示すはずであり、そのパワースペクトルははっきりと識別可能な等方性のトーンリングを示すべきである。それらが可視である空間周波数は、ほとんどの場合、構造が原則的に最終的に決定されることができる最高解像度を規定する。十分な品質とそのパワースペクトルの動き補正された平均の例は、セクション＃最終的な結果に悪影響を与える可能性のある異常画像は、SPHIREのDriftおよびCTFアセスメントGUIツール（http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php）の助けを借りて除去することができます。 パーティクルスクリーニングに関して、SPHIREパイプラインの重要なステップは、ISAC（ プロトコルステップ5.2）を使用した2D分類です。ここで、ユーザは、プログラムによって自動的に識別された再現可能な2Dクラス平均が、角度空間を準平準にカバーするのに十分な方向の範囲を採用するように制御すべきである。クラス平均の品質が満足できるものではない場合（ノイズの多い画像やぼやけた画像）、再現可能なクラス平均の数が非常に少ない場合は、自動ピッキング品質の改善、データセットのイメージングまたはサンプルの作成の最適化を検討してください。ほとんどの場合、良好な2Dクラス平均が得られないデータセットから信頼性の高い再構成を計算することはできません。高品質2Dクラスの例怒りは「代表的な結果」のセクションに示されています。 自動化された方法でRVIPERを使用して信頼性の高い初期3Dモデルを得るには、少なくとも100のクラス平均が必要です（ プロトコルステップ6.1 ）。このステップでは、ユーザは、最高品質の平均を選択し、可能な限り多くの異なる方向の粒子を含むべきである。初期モデルの品質は、その後の高解像度3D精緻化の成功のために重要である。 他のソフトウェアパッケージでは、「悪い」粒子8,9を除去するために3D分類が行われることがあります。しかし、SPHIREでは、ISACを使用して2次元分類を行う際に、これらの粒子のほとんどが自動的に削除されます。したがって、再構成および3D変動分析がデータセットの異質性を示す場合にのみ、3Dソーティングの計算集約的なステップを実行することが推奨されます。 最も重要なことは、ユーザーは常に、得られた3Dボリュームを注意深く注意深く検査し（ プロトコルステップ9.3 ）、それぞれの密度の特徴が公称解像度とよく一致することを確認する必要があります。 &lt;9Åの分解能では、α-ヘリックスに対応する棒状の密度が見えるようになる。 4.5Å未満の分解能では、βシート中の鎖に対応する密度は、通常、十分に分離され、かさばったアミノ酸が見えるようになる。高分解能マップ（&lt;3Å）では、明確な識別可能な側鎖が示され、正確な原子モデルの構築が可能になります。 今日までに得られた結果は、SPHIREの自動再現性試験および最小限の視覚検査の助けを借りて、現在のプロトコールが一般にあらゆるタイプの単一粒子クライオEMプロジェクトに適用可能であることを実証している。各処理工程の代表的な結果は、TcdA1毒素の再構築のために示されているPhotorhabdus luminescens 21であり 、これはほぼ原子分解能に解決されている。同様の品質の密度マップを使用して、デボリューションバックボーントレースと逆数または実空間のリファインメントによる信頼性の高い原子モデルを構築することができ、複雑な分子メカニズムを理解するための強固な構造フレームワークを提供します。 ACCESION CODES： EM構造および未処理の映画のための座標は、それぞれ、受託番号EMD-3645およびEMPIAR-10089で、電子顕微鏡データバンクおよび電子顕微鏡画像ファイルアーカイブに寄託されている。

直接電子検出器技術の開発後、単粒子低温EMの顕著な進歩は現在、構造生物学を改造している1 。 X線結晶学と比較して、この技術は結晶化を必要とせずに少量のタンパク質材料しか必要とせず、同時に試料の純度に関する制約が少なく、しかも原子分解能近くの構造の決定を可能にする。重要なことに、異なる組成物または状態をコンピュータで分離することができ、異なる立体配座の構造決定を前例のない詳細レベルで行うことができる。最近、デノボモデルの構築を可能にする解像度で、挑戦する分子の密度マップを生成することができ、従って、それらの作用様式の深い理解2,3,4,5。 3DEM（3D Electron Microscopy）コミュニティ（https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy）で幅広い種類の画像処理ソフトウェアパッケージが利用可能であり、そのほとんどは継続的に開発されています。 EMAN2 6 、IMAGIC 7 、FREALIGN 8 、RELION 9 、SPIDER 10 、およびSPARX 11を含むいくつかの異なるソフトウェアパッケージを用いて、様々な分子量および対称性を示すタンパク質について、ほぼ原子分解能が達成されている。各パッケージは、異なるレベルのユーザー専門知識を必要とし、異なるレベルのユーザーガイダンス、自動化および拡張性を提供します。さらに、いくつかのプログラムは、画像解析のすべてのステップを容易にするための完全な環境を提供する一方、他のプログラムは、既知のrから始まるアラインメントパラメータの改良など、特定のタスクを最適化するように設計されている推論構造。より最近では、APPION 12およびSCIPION 13を含むいくつかのプラットフォームが開発されており、上で列挙した様々なソフトウェアパッケージからのアプローチおよびプロトコルを統合する単一処理パイプラインを提供している。 低温EMの現在の発展に貢献するために、SPARXはSPHIRE（高分解能電子顕微鏡用SPARX）と呼ばれる単粒子分析のための新しいスタンドアロンで完全なプラットフォームに再開発されました。現場の新しい研究者のための技術のアクセシビリティを高め、現代の全自動ハイエンド電子顕微鏡によって生成された大量のデータに対処するために、処理パイプラインは使い易いグラフィカルユーザーインターフェイス（GUI）を使用して、ワークフローの主要なステップを自動化します。さらに、crからの迅速かつ再現可能かつ自動化された構造決定を可能にするための新しいアルゴリズムが追加されましたyo-EM画像。さらに、再現性による検証は、洗練および異質性分析中に生成される共通のアーチファクトを回避するために導入された。 このプログラムは大幅に変更されていますが、簡単なオープンソースコード、最新のオブジェクト指向設計、すべての基本機能のためのPythonインターフェイスなど、その重要な機能が維持されています。したがって、ブラックボックスプログラムに変更されていないため、ユーザーはPythonコードを学習して簡単に修正したり、追加のアプリケーションを作成したり、全体的なワークフローを変更したりすることができます。これは、非標準Cryo-EMプロジェクトに特に便利です。 ここでは、SPHIREのGUIを使用して低温EM画像から原子に近い解像度の密度マップを得るためのプロトコルを示します。生の低温EM直接検出器の映画から密度マップを生成するために必要とされるすべてのステップを詳細に記述しており、特定の巨大分子タイプに限定されるものではない。このプロトコルは、主にnewc現場でワークフローを説明し、処理の重要なステップと可能性のある落とし穴や障害に関する重要な情報を提供します。より高度な機能と、SPHIREの背後にある理論的背景については、他の箇所で説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE（高分解能電子顕微鏡用スパークス）は、単粒子電子冷凍顕微鏡（クライオEM）データの半自動処理のための、オープンソースで使いやすいソフトウェアスイートです。ここに提示されたプロトコルは、単一粒子構造決定パイプラインの全ステップを通してユーザを導くことにより、低温EM顕微鏡写真映画から始まる原子に近い解像度の構造を得る方法を詳細に説明している。これらの手順は、新しいSPHIREグラフィカルユーザーインターフェイスから制御され、ユーザーの操作を最小限に抑える必要があります。このプロトコールを使用して、Photorhabdus luminescensからのTc毒素複合体であるTcdA1の3.5Å構造は、9500個の単一粒子からのみ得られた。この合理化されたアプローチは、自然な状態で精製された巨大分子複合体のノイズのない、偏っていない原子モデルを得るために、広範な処理経験と先験的な構造情報なしで初心者ユーザを助けるでしょう。

<html>上記のプロトコルは、 Photorhabdus luminescens Tc複合体（TcdA1） 20,21,22の A成分の112個の直接検出器映画から開始して実行した。このデータセットは、300kVの加速電圧で動作する高輝度電界放出ガン（XFEG）を備えたCs補正電子凍結顕微鏡で記録した。画像は、標本スケールで1.14Åの画素サイズで60e - /Å -2の総線量で自動的に取得された。ムービーフレームのアライメント後（ プロトコルステップ2 ）、結果として得られたモーション補正された平均値は、等方性のトーンリングが高解像度に拡張されていました（ 図2a ）。個々の粒子は容易に目に見え、よく分離していた（ 図2b ）。次に、e2boxerの群ツールを使用してパーティクルを選んだlass = &quot;xref&quot;&gt; 18（ プロトコルステップ4.1 ）。この場合、より選択的なオプションを使用して適切な閾値を設定した（ 図2c ）。 112のデジタル顕微鏡写真は9,652個の粒子を生じた。抽出された画像の大部分（ プロトコルステップ4.2 ）は、明確に定義された粒子を含み、そのボックスサイズは、推奨されるように、粒子サイズの約1.5倍であった（ 図2d ）。次に、ISACを用いて、2D異種性分析を実施した（ プロトコールステップ5 ）。それは98のクラス平均をもたらした（ 図3a ）。これらの2Dクラス平均を用いて、中間分解能でVIPER（ プロトコルステップ6 ）を用いてab initioモデルを計算した（ 図3b ）。このモデルは、以前に3.9Åの分解能22で解決されたTcdA1の結晶構造との優れた一致を示す（ 図3c ）。このab initioモデルは、初期状態として使用された<html> （MERIDIEN）を用いて、約40,000個の非対称単位のみから3.5Å（0.143基準）再構成（ プロトコルステップ7 ）を得た（ 図4 ）。この原子に近い分解能のマップは、複数のコアの恩恵を受けるワークフローのステップで最大96個のCPUを使用して24時間以内に取得されました。 3次元変動分析（プロトコルステップ8）では、ステップ8.3.3でグループあたり2,000個の粒子画像のみが使用された（ すなわち 、プロセスは5個の初期3Dグループから開始する）。ステップ8.3.4で最小グループサイズ少数の粒子（〜10,000）。この分析は、主に、精製に使用されるHisタグを含む複合体のN末端領域で局所的な柔軟性を明らかにした（ 図5a ）。実際、TcdA1の以前に公開された結晶構造では、12個のN末端残基およびHisタグは分解されなかった受容体結合ドメインおよびBC結合​​ドメインでさらなる変動性が検出された（ 図5a ）。全体的にみて（ 図5a ）、この変動は、現在の低温EM密度において未解決のままであった。この構造の不均一性は許容可能であると判断され、したがって焦点を当てた3D分類23は行われなかった。最後に、最終濃度マップの局所分解能が計算された（ プロトコルステップ9.1、図この品質のボリュームは、Coot 24やその他のリファインメントツール（ 図6 ）を使用した新モデル構築に使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;図1：SPHIREを使用した画像処理。 （ a ）SPHIREソフトウェアパッケージのGUI。ワークフローの特定のステップは、GUIの左側（「ワークフローステップ」）のそれぞれの絵文字を選択することによってアクティブにすることができます。ワークフローのこのステップに関連するコマンドとユーティリティは、GUIの中央領域に表示されます。コマンドの1つを選択すると、それぞれのパラメータがGUIの右側の領域に表示されます。高度なパラメータは通常、プリセットされたデフォルト値の変更を必要としません。 （ b ）SPHIRE GUIを用いた単一粒子画像処理のワークフローにおける段階。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> 図2：動きの補正と部分le抽出。 （ a 、 b ）1.7μmのデフォーカスで記録された典型的な高品質、低線量、ドリフト補正されたデジタル顕微鏡写真。パワースペクトル（a）において2.7オングストロームの分解能で伸びる等方性のトーンリングと、2D画像（ b ）における十分に識別可能な粒子に注目されたい。 （ c ）e2boxerを用いた粒子の選択。緑色の円は選択された粒子を示します。 （ d ）用量加重顕微鏡写真から抽出した典型的な生の粒子。スケールバー= 20nm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> 図3：2Dクラスタリングと初期モデル生成。 （ a ）2階級クラスの平均のギャラリー、多数の側面図を表すo<html>粒子。スケールバー= 20nm。 （ b ）参照フリークラスの平均からRVIPERを用​​いて得られたTcdA1のAb initio 3Dマップ。 （ c ）TcdA1結晶構造（リボン）（pdb-id 1VW1）の最初の低温EM密度（透明灰色）への剛体適合。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> 図4：TcdA1のクライオEM 3D構造。 （ a 、 b ）約9,500個の粒子画像を用いて計算されたTcdA1の最終3.5Å密度マップ：（ a ）側面および（ b ）上面図。 （ c ）αヘリックスおよびβシートの低温EM密度の代表的な領域。arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> 図5：変動分析とローカル解決。 （ a ）鋭利なTcdA1低温EMマップの表面（灰色）および可変性マップ（緑色）。より明確にするために、可変性マップを30Åまでローパスフィルタリングした。 （ b ）TcdA1鮮鋭化低温EMマップの表面レンダリングは、局所分解能（Å）に従って着色した。高いばらつきのある領域と低い局所分解能の間のトポロジカルな一致に注意してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> 図6：3DモードCootを用いたTcdA1の構築。低温EM密度および原子モデルの代表的な領域がα-ヘリックスについて示されている。原子モデルは、Cootを使用して新しく構築されました。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。

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