Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Vi takker D. Roderer for å gi oss TcdA1 mikrografer. Vi takker Steve Ludtke for hans løpende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Max Planck Society (til SR) og Det europeiske råd under EUs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (stipend nr. 615984) (til SR) og tilskudd fra National Institutes of Helse R01 GM60635 til PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Enkeltpartikkel-kryo-EM har vist en rask utvikling i de senere år og levert mange atomoppløsningsstrukturer av makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For å støtte det store antallet nybegynnere som går inn i feltet, utviklet vi single-particle image analyse plattformen SPHIRE og presenterer her en gjennomgående protokoll for hele arbeidsflyten, inkludert filmjustering, partikkel plukking, CTF estimering, innledende modell Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, 3D-raffinement med høy oppløsning og lokal oppløsning estimering og filtrering. Protokollen beskrevet her er ment som en kort guide til 3D-strukturbestemmelse ved bruk av cryo-EM mikrografer av proteinet av interesse og ved hjelp av beregningsverktøy som tilbys av det frittstående GUI av SPHIRE. Hovedtrekk i arbeidsflyten er det mestAv prosedyrene må bare kjøres én gang, siden de stoler på konseptet om validering ved reproduserbarhet 19 og krever ingen parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanismen er en hovedfordel for SPHIRE over andre programvarepakker, siden resultatene pleier å være objektive samt reproduserbare og, viktigst, oppnåelig ved en akseptabel beregningskostnad. Rørledningen gir i tillegg et vell av diagnostisk informasjon for erfarne brukere å gjennomføre ytterligere uavhengig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynner som har minst elementær teoretisk bakgrunn i strukturell biologi og elektronmikroskopi, kunne oppnå nær-atomoppløsningskonstruksjoner ved å bruke egne data og de automatiserte valideringsprosedyrene. Imidlertid er det ikke alltid lett å skaffe seg en nær-atomoppløsningskonstruksjon, og resultatet vil høyt avhenge av kvaliteten på prøven og inngangsdataeten. For prosedyrene som presenteres her antas det at et tilstrekkelig antall ujevnede rå EM-filmer av høy kvalitet er tilgjengelige, med gjennomsnitt som viser tydelig merkbare homogene og tilfeldig orienterte enkeltpartikler. Generelt er det ingen begrensninger for molekylets symmetri, størrelse eller overordnede form, men en lavmolekylvekt kan være en begrensende faktor, spesielt når proteinet har en featurløs kuleform. Vanligvis er analyse av større, velordnede partikler med høypunkts-gruppesymmetri mindre krevende. Derfor anbefales det sterkt for nybegynnere å kjøre dagens protokoll først med et godt karakterisert cryo-EM datasett. Enten SPHIRE opplæringsdataene (http: /sphire.mpg.de) eller et av EMPIAR-innsendte datasettene (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilmer er et godt utgangspunkt . Når du behandler egne data, er det svært sannsynlig at enkelte datasett eller noen av bildene ikke tilfredsstiller visse kvalifikasjonerTy kriterier. I tillegg til dette, i tillegg til de automatiserte stabilitets- og reproduserbarhetskontrollene som utføres av programmet for de viktigste trinnene i arbeidsflyten, anbefales det fortsatt at brukerne visuelt inspiserer resultatene ved bestemte &quot;kontrollpunkter&quot; i protokollen, spesielt hvis den endelige rekonstruksjonen Er ikke tilfredsstillende. Den første visuelle inspeksjonen kan gjøres på mikrografnivået etter filmjusteringen (protokoll trinn 2 ) og CTF estimeringen (protokoll trinn 3 ). De resulterende bevegelseskorrigerte gjennomsnitt skal vise klart merkbare og velskilte partikler, og deres effektspekter skal vise tydelige, isotrope Thon-ringer. Den romlige frekvensen som de er synlige, definerer i de fleste tilfeller den høyeste oppløsningen som strukturen i utgangspunktet kan bestemmes til slutt. Eksempler på et bevegelseskorrigert gjennomsnitt av tilstrekkelig kvalitet og dens strømspektrum er vist i avsnittet &amp; #34; Representative resultater. &quot;Outlier bilder som kan ha en negativ innvirkning på sluttresultatet, kan fjernes ved hjelp av SPHIREs GUI-verktøy for drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). Med hensyn til partikkelscreening er det avgjørende trinnet i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifiseringen ved bruk av ISAC (protokoll trinn 5.2) . Her skal brukeren kontrollere at de reproduserbare 2D-klassens gjennomsnitt identifiseres automatisk ved at programmet vedtar en rekke retninger som er tilstrekkelig til å kvasjevikt dekke vinkelrommet. Hvis kvaliteten på klassenes gjennomsnitt ikke er tilfredsstillende (støyende og / eller uskarpe bilder) og / eller antall reproduserbare klasse gjennomsnitt er svært lav, bør du vurdere å forbedre automatisk plukkingskvalitet, optimalisere datasettbilder eller prøvepreparering. I de fleste tilfeller er det ikke mulig å beregne en pålitelig rekonstruksjon fra et datasett som ikke gir gode 2D klasse gjennomsnitt. Eksempler på høy kvalitet 2D klasse aveRaser er vist i avsnittet &quot;Representative resultater&quot;. Det kreves minst 100 klassemidlere for å oppnå en pålitelig innledende 3D-modell ved hjelp av RVIPER på en automatisk måte (protokoll trinn 6.1 ). For dette trinnet bør brukeren velge gjennomsnittet med høyeste kvalitet og inkludere så mange forskjellige orienteringer av partikkelen som mulig. Kvaliteten på den innledende modellen er kritisk for suksessen til den etterfølgende 3D-raffinement med høy oppløsning. I andre programvarepakker utføres noen ganger 3D-klassifisering for å fjerne &quot;dårlige&quot; partikler 8 , 9 . Imidlertid i SPHIRE elimineres de fleste av disse partiklene automatisk allerede under 2D-klassifisering ved bruk av ISAC. Det anbefales derfor å utføre det beregningsintensive trinnet med 3D-sortering bare hvis rekonstruksjonen og 3D-variabilitetsanalysen indikerer heterogenitet av datasettet. Viktigst av alt, må brukeren nøye inspisere de resulterende 3D-volumene nøye (Protokoll trinn 9.3 ), og bekrefte at egenskapene til den aktuelle tettheten stemmer godt overens med den nominelle oppløsningen. Ved en oppløsning på &lt;9 Å blir stangliknende tettheter tilsvarende a-helixer synlige. Ved en oppløsning &lt;4.5 Å, er tettheter som tilsvarer tråder i β-ark, normalt godt separert og omfangsrike aminosyrer blir synlige. Et kart med høy oppløsning (&lt;3 Å) skal vise tydelig merkbare sidekjeder, slik at byggingen av en nøyaktig atommodell kan bygges. Resultatene som er oppnådd hittil, viser at ved hjelp av SPHIREs automatiserte reproduksjonsprøver og minimal visuell inspeksjon, er foreliggende protokoll generelt anvendelig for alle typer enkeltpartikkel-kryo-EM-prosjekter. Representative resultater fra hvert behandlingstrinn er vist for rekonstruksjon av TcdA1-toksinet avPhotorhabdus luminescens 21 , som har blitt løst til nær-atomoppløsning. Tetthetskart av tilsvarende kvalitet kan brukes til å konstruere pålitelige atommodeller ved hjelp av de novo ryggradssporing samt gjensidig eller real-space-raffinering, og derved gi et solidt strukturelt rammeverk for forståelse av komplekse molekylære mekanismer. TILTAK KODER: Koordinatene for EM-strukturen og de ubehandlede filmene er deponert i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltaksnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.

Etter utviklingen av direkte elektrondetektorteknologien omformes den bemerkelsesverdige fremdriften i single particle cryo-EM for tiden strukturell biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi krever denne teknikken kun en liten mengde proteinmateriale uten behov for krystallisering, samtidig som det stilles færre restriksjoner på renhet av prøven og fortsatt tillater bestemmelse av strukturer ved næratomisk oppløsning. Viktig er at forskjellige komposisjoner eller tilstander nå kan beregnes separat og strukturbestemmelse av de forskjellige konformasjoner kan utføres på enestående detaljnivå. Nylig kunne tetthetskart av utfordrende molekyler bli produsert ved oppløsninger som tillater de novo modellbygging og dermed dyp forståelse av deres virkemåte 2 , 3 , 4 , 5. Et bredt utvalg av programvare for bildebehandling er tilgjengelig i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfunnet (https://no.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste av dem er under kontinuerlig utvikling. Nær-atomoppløsning er oppnådd for proteiner som har forskjellige molekylvekter og symmetrier med flere forskjellige programvarepakker, inkludert EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke krever et annet nivå av brukerkompetanse og gir et annet nivå av brukerveiledning, automatisering og utvidbarhet. Dessuten, mens noen programmer gir komplette miljøer for å lette alle trinnene i bildeanalyse, er andre designet for å optimalisere bestemte oppgaver, for eksempel forfining av justeringsparametere som starter fra en kjent rEference struktur. I nyere tid har flere plattformer blitt utviklet, inkludert APPION 12 og SCIPION 13 , som gir en enkeltbehandlingsrørledning som integrerer tilnærminger og protokoller fra de forskjellige programvarepakker som er oppført ovenfor. For å bidra til den nåværende utviklingen av cryo-EM, ble SPARX videreutviklet til en ny frittstående og komplett plattform for enkeltpartikkelanalyse, kalt SPHIRE (SPARX for High Resolution Electron Microscopy). For å øke tilgjengeligheten av teknikken til nye forskere på feltet og å takle den store mengden data produsert av moderne fullautomatiserte high-end elektronmikroskoper, ble prosesseringsrøret redesignet og forenklet ved å introdusere en brukervennlig Grafisk brukergrensesnitt (GUI) og automatisering av de viktigste trinnene i arbeidsflyten. Videre ble nye algoritmer tilsatt for å tillate rask, reproduserbar og automatisert strukturbestemmelse fra crYo-EM bilder. Videre ble validering ved reproduserbarhet introdusert for å unngå vanlige artefakter produsert under raffinering og heterogenitetsanalyse. Selv om programmet var omfattende endret, ble de verdsatt kjernefunksjonene opprettholdt: rettferdig åpen kildekode, det moderne objektorientert design og Python-grensesnitt for alle grunnleggende funksjoner. Dermed ble det ikke endret til et svart boks program, slik at brukerne kan studere og enkelt endre Python-koden, for å lage flere applikasjoner eller endre den samlede arbeidsflyten. Dette er spesielt nyttig for ikke-standardiserte kryo-EM-prosjekter. Her presenterer vi en protokoll for å skaffe et nær-atom-oppløsningstetthetskart fra cryo-EM-bilder ved hjelp av SPI-GUI. Det beskriver i detalj alle trinn som kreves for å generere et tetthetskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilmer og er ikke begrenset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokollen skal primært veilede newcOmers i feltet gjennom arbeidsflyten og gi viktig informasjon om viktige trinn i behandlingen, samt noen av de mulige fallgruvene og hindringene. Mer avanserte funksjoner og den teoretiske bakgrunnen bak SPHIRE vil bli beskrevet andre steder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX for høyoppløselig elektronmikroskopi) er en ny åpen kildekode, brukervennlig programvarepakke for halvautomatisert behandling av enkeltpartikkel-elektronkryo-mikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen som presenteres her, beskriver i detalj hvordan man oppnår en nær-atomoppløsningsstruktur som starter fra cryo-EM mikrograph-filmer ved å lede brukerne gjennom alle trinnene i enkeltpartikkelstrukturbestemmelsesrørledningen. Disse trinnene styres fra det nye grafiske brukergrensesnittet SPHIRE og krever minimum brukerintervensjon. Ved bruk av denne protokollen ble en 3,5 Å-struktur av TcdA1, et Tc- toksinkompleks fra Photorhabdus luminescens , avledet fra bare 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinjeformede tilnærmingen vil hjelpe nybegynnere uten omfattende behandlingserfaring og a priori strukturell informasjon for å oppnå støyfrie og upartiske atommodeller av deres rensede makromolekylære komplekser i deres opprinnelige tilstand.

<html> Protokollen beskrevet ovenfor ble utført ut fra 112 direkte detektorfilmer av A-komponenten i Photorhabdus luminescens Tc-komplekset (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Dette datasettet ble registrert på et Cs-korrigert elektronkryo-mikroskop med en høylysstyrkefeltgasspistol (XFEG), som drives ved en akselerasjonsspenning på 300 kV. Bildene ble kjøpt automatisk med en total dose på 60 e - / Å -2 ved en pikselstørrelse på 1,14 Å på prøveskalaen. Etter justering av filmrammer (Protokoll trinn 2 ) hadde de resulterende bevegelseskorrigerte gjennomsnittene isotrope Thon-ringer som strekker seg til høyoppløsningen ( figur 2a ). De enkelte partikler var lett synlige og godt separerte ( figur 2b ). Partikler ble deretter plukket ved hjelp av swarm-verktøyet til e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( protokoll trinn 4.1 ). I dette tilfellet ble det satt en passende terskel ved hjelp av det mer selektive alternativet ( figur 2c ). De 112 digitale mikrografene ga 9.652 partikler. Flertallet av de ekstraherte bildene (Protokoll Trinn 4.2 ) inneholdt veldefinerte partikler og deres boksestørrelse var ~ 1,5 ganger større enn partikkelstørrelsen, som anbefalt ( figur 2d ). Ved bruk av ISAC ble en 2D heterogenitetsanalyse utført (protokoll trinn 5 ). Det ga 98 klasse gjennomsnitt ( figur 3a ). Ved å bruke disse 2D-klassenes gjennomsnitt ble en ab initio- modell beregnet ved hjelp av VIPER (protokoll trinn 6 ) ved mellomoppløsning ( figur 3b ). Denne modellen viser utmerket avtale med krystallstrukturen til TcdA1 som tidligere ble løst ved 3,9 Å oppløsning 22 ( figur 3c ). Denne ab initio- modellen ble brukt som et innledende tema<html> Plate for 3D-raffinement (MERIDIEN), og gir en 3,5 Å (0,143 kriterium) rekonstruksjon (Protokoll Trinn 7 ) fra bare ~ 40.000 asymmetriske enheter ( Figur 4 ). Dette nær-atomoppløsningskartet ble oppnådd innen 24 timer, ved bruk av opptil 96 CPUer for trinnene i arbeidsflyten som drar nytte av flere kjerner. For 3D-variabilitetsanalysen ( Protokollstrinn 8) ble det bare brukt 2000 partikkelbilder per gruppe i trinn 8.3.3 ( dvs. prosessen starter med 5 innledende 3D-grupper) og 200 bilder for den minste gruppestørrelsen i trinn 8.3.4 på grunn av Det lille antall partikler (~ 10.000). Analysen viste lokalisert fleksibilitet hovedsakelig i den N-terminale regionen i komplekset som inneholder His-merken som ble brukt til rensing ( Figur 5a ). Faktisk ble tolv N-terminale rester og His-taggen ikke løst i den tidligere publiserte krystallstrukturen av TcdA1&quot;&gt; 22 og denne sannsynligvis forstyrrede regionen forblir uløst i den nåværende cryo-EM-tettheten, sannsynligvis på grunn av sin fleksibilitet. Ytterligere variabilitet ble påvist ved reseptorbindende domener og BC-bindingsdomene ( Figur 5a ). Tilfredsstillende oppløsning av strukturen og den relativt små størrelsen på datasettet, ble denne heterogeniteten bestemt til å være tolererbar og derfor ble det ikke utført en fokusert 3D-klassifikasjon 23. Til slutt ble den lokale oppløsningen av det endelige tetthetskartet beregnet (protokoll trinn 9.1, figur 5b ) og det skarpe 3D-kartet ble filtrert lokalt (Protokoll trinn 9.2) . Et volum av denne kvaliteten kan brukes til de novo modellbygging ved hjelp av Coot 24 eller et annet foredlingsverktøy ( figur 6 ). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; Figur 1: Bildebehandling ved hjelp av SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE programvarepakken. Et bestemt trinn i arbeidsflyten kan aktiveres ved å velge det respektive piktogrammet på venstre side av GUI (&quot;arbeidsflytstrinn&quot;). Kommandoene og verktøyene som er knyttet til dette trinnet i arbeidsflyten, vises i det sentrale området av GUI. Etter at du har valgt en av kommandoene, vises de respektive parameterne i høyre del av GUI. Avanserte parametere krever vanligvis ikke modifisering av de forhåndsinnstilte standardverdiene. ( B ) Stages i arbeidsflyten av enkeltpartikkel bildebehandling ved hjelp av SPHIRE GUI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Figur 2: Bevegelseskorrigering og partiskLe utvinning. ( A , b ) Typisk høyverdig, lavdosis, drift-rettet digital mikrograph registrert ved en defokus på 1,7 μm. Legg merke til at de isotropiske Thon-ringene strekker seg til en oppløsning på 2,7 Å i effektspekteret (a) og de velkennbare partiklene i 2D-bildet ( b ). ( C ) Partikkelvalg ved bruk av e2boxer. Grønne sirkler indikerer utvalgte partikler. ( D ) Typiske råpartikler ekstrahert fra den doseveide mikrografen. Skalestenger = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Figur 3: 2D Clustering og Initial Model Generation. ( A ) Galleri av 2D klasse gjennomsnitt, med flertallet representant sidevisninger o<html> F partikkelen. Skalbjelke = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kart over TcdA1 oppnådd ved hjelp av RVIPER fra referansefri klasse gjennomsnitt. ( C ) Kraftig montering av TcdA1-krystallstrukturen (bånd) (pdb-id 1VW1) i den opprinnelige kryo-EM-tettheten (gjennomsiktig grå). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Figur 4: Cryo-EM 3D struktur av TcdA1. ( A , b ) Endelig 3,5 Å tetthetskart over TcdA1 beregnet ved bruk av ~ 9 500 partikkelbilder: ( a ) side og ( b ) toppvisning. ( C ) Representative områder av kryo-EM-tettheten for en a-helix og en p-ark.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Figur 5: Variabilitetsanalyse og lokal oppløsning. ( A ) Overflaten på det skarpe TcdA1 cryo-EM-kartet (grått) og variabilitetskartet (grønt). For bedre klarhet ble variabilitetskortet lavpassfiltrert til 30 Å. ( B ) Overflatefjernelse av TcdA1-skarpt kryo-EM-kart farget i henhold til lokal oppløsning (Å). Legg merke til den topologiske avtalen mellom områder med stor variasjon og lav lokal oppløsning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Figur 6: 3D ModEl Bygning av TcdA1 ved hjelp av Coot. Representative regioner av kryo-EM-tettheten og atommodellen er vist for en a-helix. Atommodellen ble bygget de novo ved hjelp av Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Dette papiret presenterer en protokoll for behandling av kryo-EM-bilder ved hjelp av programvarepakken SPHIRE. Den nåværende protokollen kan brukes for nesten alle single-partikkel-EM-prosjekter som retter seg mot nær-atomoppløsning.

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Høyoppløselig Complexome profilering av Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM og enkeltpartikkelanalyse med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forbereder lameller fra glassaktige biologiske prøver ved hjelp av et dual-beam skanning elektronmikroskop for kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell flekk-og-dypfrysing av biologiske prøver for kryogen elektronmikroskopi med én partikkel

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) prosesseringsarbeidsflyt med kryoSPARC, RELION og scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Fremme høyoppløselig avbildning av virussamlinger i væske og is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...