Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
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Agradecemos a D. Roderer por nos fornecer TcdA1 micrografias. Agradecemos a Steve Ludtke pelo seu apoio contínuo à infra-estrutura EMAN2. Este trabalho foi apoiado por fundos da Sociedade Max Planck (SR) e do Conselho Europeu no âmbito do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) (subvenção n.º 615984) e subvenções dos Institutos Nacionais de Health R01 GM60635 para PAP).

<ol>
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R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O crio-EM de partícula única mostrou um rápido desenvolvimento nos últimos anos e forneceu numerosas estruturas de resolução atômica de complexos macromoleculares de maior significância biológica 25 . Para dar suporte ao grande número de usuários principiantes que atualmente estão entrando no campo, desenvolvemos a plataforma de análise de imagens de partículas únicas SPHIRE e apresentamos aqui um protocolo direto para todo o workflow, incluindo alinhamento de filmes, picking de partículas, estimativa CTF, modelo inicial Cálculo, análise de heterogeneidade 2D e 3D, refinamento 3D de alta resolução e estimativa e filtragem de resolução local. O protocolo aqui descrito pretende ser um breve guia para a determinação da estrutura 3D utilizando micrografias crio-EM da proteína de interesse e com a ajuda de ferramentas computacionais fornecidas pela GUI autónoma de SPHIRE. A principal característica do fluxo de trabalho é que a maioriaDos procedimentos precisam ser executados apenas uma vez, uma vez que se baseiam no conceito de validação por reprodutibilidade 19 e não necessitam de ajuste de parâmetros. Este mecanismo de validação automática é uma vantagem principal do SPHIRE sobre outros pacotes de software, uma vez que os resultados tendem a ser objectivos, bem como reprodutíveis e, o mais importante, obtidos a um custo computacional aceitável. O pipeline fornece além disso uma riqueza de informações de diagnóstico para usuários experientes para realizar validação e avaliação independente com métodos próprios. No entanto, um usuário iniciante que tenha, pelo menos, conhecimentos teóricos elementares em biologia estrutural e microscopia eletrônica, deve ser capaz de obter estruturas de resolução atômica usando dados próprios e os procedimentos automatizados de validação. No entanto, a obtenção de uma estrutura de resolução quase atômica nem sempre é direta eo resultado dependerá muito da qualidade da amostra e da entradauma. Para os procedimentos aqui apresentados, presume-se que existe um número suficiente de filmes EM não alinhados de alta qualidade de alta qualidade, com as suas médias mostrando claramente partículas homogéneas e orientadas aleatoriamente. Em geral, não há restrições quanto à simetria, tamanho ou forma geral da molécula, mas um baixo peso molecular pode ser um fator limitante, especialmente quando a proteína tem uma forma globular sem traços. Normalmente, a análise de partículas maiores, bem ordenadas, com simetria de grupos pontuais elevados é menos exigente. Portanto, é altamente recomendável que usuários iniciantes executem o protocolo presente primeiro com um conjunto de dados crio-EM bem caracterizado. Os dados do tutorial SPHIRE (http: /sphire.mpg.de) ou um dos conjuntos de dados enviados pelo EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) com filmes crus são um bom ponto de partida . Ao processar dados próprios, é muito provável que alguns conjuntos de dados ou algumas das imagens não satisfaçam certos requisitosCritérios de elegibilidade. Neste contexto, além das verificações automatizadas de estabilidade e reprodutibilidade, realizadas pelo programa para as principais etapas do fluxo de trabalho, ainda é recomendável aos usuários inspecionar visualmente os resultados em certos &quot;pontos de verificação&quot; do protocolo, especialmente se a reconstrução final Não é satisfatória. A primeira inspeção visual pode ser feita no nível micrográfico após o alinhamento do filme ( etapa 2 do protocolo) e a estimativa do CTF ( etapa 3 do protocolo). As médias de movimento corrigidas resultantes devem mostrar partículas claramente discerníveis e bem separadas e seus espectros de potência devem mostrar anéis de Thon claramente visíveis e isotrópicos. A frequência espacial para a qual são visíveis define, na maioria dos casos, a maior resolução para a qual a estrutura pode, em princípio, ser determinada em última instância. Exemplos de uma média corrigida de movimento de qualidade suficiente e seu espectro de potência são mostrados na seção &amp; #34. Resultados representativos &quot;As imagens que podem ter um impacto negativo no resultado final podem ser removidas com a ajuda das ferramentas GUI de Drift e CTF da SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). No que diz respeito à triagem de partículas, o passo crucial no pipeline SPHIRE é a classificação 2D usando o ISAC ( passo 5.2 do protocolo ) . Aqui, o utilizador deve controlar que as médias de classe 2D reprodutíveis identificadas automaticamente pelo programa adoptem uma gama de orientações suficientes para cobrir quase uniformemente o espaço angular. Se a qualidade das médias de classe não for satisfatória (imagens barulhentas e / ou embaçadas) e / ou o número de médias de classes reprodutíveis for muito baixo, considere melhorar a qualidade de picking automático, otimizando a geração de imagens ou a preparação da amostra. Na maioria dos casos, não é possível calcular uma reconstrução confiável a partir de um conjunto de dados que não gere boas médias de classes 2D. Exemplos de classe 2D de alta qualidade aveSão apresentadas na secção &quot;Resultados representativos&quot;. Pelo menos 100 médias de classe são necessárias para obter um modelo 3D confiável inicial usando RVIPER de forma automatizada (Protocolo passo 6.1 ). Para esta etapa, o usuário deve selecionar as médias com a mais alta qualidade e incluir tantas orientações diferentes quanto possível da partícula. A qualidade do modelo inicial é fundamental para o sucesso do subsequente refinamento 3D de alta resolução. Em outros pacotes de software, a classificação 3D às vezes é realizada para remover partículas &quot;ruins&quot; 8 , 9 . No entanto, em SPHIRE a maioria dessas partículas são automaticamente eliminadas já durante a classificação 2D usando ISAC. Assim, recomenda-se executar o passo computacionalmente intensivo da ordenação 3D somente se a reconstrução ea análise de variabilidade 3D indicarem heterogeneidade do conjunto de dados. O mais importante é que o usuário deve sempre inspecionar cuidadosamente os volumes 3D resultantes cuidadosamente ( etapa 9.3 do protocolo) e confirmar que as características da respectiva densidade concordam bem com a resolução nominal. Com uma resolução &lt;9 Å, as densidades semelhantes a vara correspondentes às hélices-a tornam-se visíveis. Com uma resolução &lt;4,5 Å, as densidades correspondentes às cadeias nas folhas ß são normalmente bem separadas e os aminoácidos volumosos tornam-se visíveis. Um mapa de alta resolução (&lt;3 Å) deve mostrar claramente discernível cadeias laterais, permitindo assim a construção de um modelo atômico preciso. Os resultados obtidos até à data demonstram que, com a ajuda dos testes automatizados de reprodutibilidade do SPHIRE e de inspeções visuais mínimas, o presente protocolo é geralmente aplicável a qualquer tipo de projeto de crio-EM de partículas únicas. Resultados representativos de cada passo de processamento são mostrados para a reconstrução da toxina TcdA1 dePhotorhabdus luminescens 21 , que foi resolvido para resolução quase atômica. Mapas de densidade de qualidade semelhante podem ser usados ​​para construir modelos atômicos confiáveis ​​por traçado de novo backbone, bem como recíproco ou real-espaço refinamento e, assim, fornecer uma estrutura sólida estrutura para a compreensão dos mecanismos moleculares complexos. CÓDIGOS DE ACESSO: As coordenadas da estrutura EM e os filmes não processados ​​foram depositados no Banco de Dados de Microscopia Electrónica e no Arquivo de Imagem Piloto de Microscopia Electrónica com os números de acesso EMD-3645 e EMPIAR-10089, respectivamente.

Após o desenvolvimento da tecnologia de detector de elétrons diretos, o notável progresso no crio-EM de partículas únicas está atualmente reformulando a biologia estrutural 1 . Comparada com a cristalografia de raios X, esta técnica requer apenas uma pequena quantidade de material proteico sem a necessidade de cristalização, ao mesmo tempo que apresenta menos restrições quanto à pureza da amostra e ainda permite a determinação de estruturas com uma resolução quase atómica. Importantemente, composições ou estados diferentes podem agora ser separados computacionalmente e a determinação da estrutura das diferentes conformações pode ser realizada num nível de detalhe sem precedentes. Recentemente, mapas de densidade de moléculas desafiadoras podem ser produzidos em resoluções que permitam a construção de modelos de novo e, portanto, uma compreensão profunda de seu modo de ação 2 , 3 , 4 , 5. Uma grande variedade de pacotes de software de processamento de imagem estão disponíveis na comunidade 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ea maioria deles está em desenvolvimento contínuo. Foi conseguida uma resolução quase atómica para proteínas que exibem vários pesos moleculares e simetrias com vários pacotes de software diferentes, incluindo EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 e SPARX 11 . Cada pacote requer um nível diferente de experiência do usuário e fornece um nível diferente de orientação do usuário, automação e extensibilidade. Além disso, enquanto alguns programas fornecem ambientes completos para facilitar todas as etapas de análise de imagem, outros são projetados para otimizar tarefas específicas, como o refinamento de parâmetros de alinhamento a partir de um rEstrutura de referência. Mais recentemente, várias plataformas foram desenvolvidas, incluindo APPION 12 e SCIPION 13 , que fornecem um único pipeline de processamento que integra abordagens e protocolos dos diferentes pacotes de software listados acima. Para contribuir com o desenvolvimento atual de cryo-EM, a SPARX foi re-desenvolvida em uma nova plataforma autônoma e completa para análise de partículas únicas, chamada SPHIRE (SPARX para Microscopia Eletrônica de Alta Resolução). A fim de aumentar a acessibilidade da técnica para os novos pesquisadores no campo e lidar com a grande quantidade de dados produzidos por modernos modernos microscópios eletrônicos high-end, a linha de processamento foi redesenhado e simplificado através da introdução de um fácil de usar Interface Gráfica do Usuário (GUI) e automatizando as principais etapas do fluxo de trabalho. Além disso, novos algoritmos foram adicionados para permitir a determinação rápida, reproduzível e automatizada da estrutura de crImagens yo-EM. Além disso, a validação por reprodutibilidade foi introduzida para evitar artefatos comuns produzidos durante a análise de refinamento e heterogeneidade. Embora o programa tenha sido amplamente modificado, suas características principais apreciadas foram mantidas: código open-source direto, o moderno design orientado a objetos e interfaces Python para todas as funções básicas. Assim, ele não foi alterado em um programa de caixa preta, permitindo aos usuários estudar e modificar facilmente o código Python, criar aplicativos adicionais ou modificar o fluxo de trabalho geral. Isso é especialmente útil para projetos não-padrão cryo-EM. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de um mapa de densidade de resolução quase atômica a partir de imagens cryo-EM usando a GUI de SPHIRE. Ele descreve detalhadamente todas as etapas necessárias para gerar um mapa de densidade a partir de filmes criados diretos cryo-EM de detector direto e não está restrito a qualquer tipo particular de macromolécula. Este protocolo pretende principalmente orientar newcOmers no campo através do fluxo de trabalho e fornecem informações importantes sobre etapas cruciais do processamento, bem como algumas das possíveis armadilhas e obstáculos. As características mais avançadas e o fundo teórico atrás de SPHIRE serão descritos em outra parte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX para Microscopia Eletrônica de Alta Resolução) é uma nova suíte de software open-source, user-friendly para o processamento semi-automático de dados de crio-microscopia eletrônica de partícula única (cryo-EM). O protocolo aqui apresentado descreve em pormenor como obter uma estrutura de resolução quase atómica a partir de filmes de micrografia crio-EM guiando os utilizadores através de todas as etapas do pipeline de determinação de estrutura de partícula única. Essas etapas são controladas a partir da nova interface gráfica SPHIRE e requerem uma intervenção mínima do usuário. Utilizando este protocolo, uma estrutura de 3,5 ï¿½ de TcdA1, um complexo de toxina Tc de Photorhabdus luminescens , foi derivada de apenas 9500 partï¿½ulas isoladas. Essa abordagem simplificada ajudará os usuários novatos sem experiência extensiva de processamento e informações estruturais a priori , para obter modelos atômicos isentos de ruído e isentos de seus complexos macromoleculares purificados em seu estado nativo.

<html> O protocolo acima descrito foi executado a partir de 112 filmes de detecção directa do componente A do complexo Tc de Photorhabdus luminescens (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Este conjunto de dados foi registado num crio-microscópio de electrões Cs-corrigido com uma pistola de emissão de campo de alto brilho (XFEG), operado a uma tensão de aceleração de 300 kV. As imagens foram adquiridas automaticamente com uma dose total de 60 e - / Å -2 com um tamanho de pixel de 1,14 Å na escala da amostra. Após o alinhamento dos quadros de filme (Protocolo Passo 2 ), as médias corrigidas por movimento resultantes tinham anéis Thon isotrópicos estendendo-se para alta resolução ( Figura 2a ). As partículas individuais eram facilmente visíveis e bem separadas ( Figura 2b ). As partículas foram então colhidas utilizando a ferramenta swarm do e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( Protocolo Passo 4.1 ). Neste caso, foi estabelecido um limiar adequado utilizando a opção mais selectiva ( Figura 2c ). As 112 micrografias digitais produziram 9.652 partículas. A maioria das imagens extraídas (Protocolo Passo 4.2 ) continha partículas bem definidas e seu tamanho de caixa era ~ 1,5 vezes maior que o tamanho de partícula, como recomendado ( Figura 2d ). Em seguida, utilizando ISAC, foi realizada uma análise de heterogeneidade 2D (Protocolo Passo 5 ). Rendia 98 médias de classe ( Figura 3a ). Utilizando estas médias de classes 2D, calculou-se um modelo ab initio utilizando VIPER (Protocolo Passo 6 ) a uma resolução intermédia ( Figura 3b ). Este modelo mostra excelente concordância com a estrutura cristalina de TcdA1 previamente resolvida a 3.9 Å de resolução 22 ( Figura 3c ). Este modelo ab initio foi usado como<html> Para o refinamento 3D (MERIDIEN), proporcionando uma reconstrução de 3,5 Å (0,143) (Protocolo Etapa 7 ) de apenas ~ 40 000 unidades assimétricas ( Figura 4 ). Este mapa de resolução quase atômica foi obtido em 24 h, usando até 96 CPUs para as etapas do fluxo de trabalho que se beneficiam de múltiplos núcleos. Para a análise de variabilidade 3D (passo 8 do protocolo ), apenas 2.000 imagens de partículas por grupo foram utilizadas no passo 8.3.3 ( ou seja, o processo começa com 5 grupos 3D iniciais) e 200 imagens para o menor tamanho de grupo no passo 8.3.4 devido a O pequeno número de partículas (~ 10.000). A análise revelou flexibilidade localizada principalmente na região N-terminal do complexo que contém a marca His usada para purificação ( Figura 5a ). De facto, doze resï¿½uos N-terminais e a marca His nï¿½ foram resolvidos na estrutura cristalina previamente publicada de TcdA1&quot;22 e esta região mais provavelmente desordenada permaneceu não resolvida na actual densidade de crio-EM, provavelmente devido à sua flexibilidade. Foi detectada uma variabilidade adicional nos domínios de ligação ao receptor e no domínio de ligação BC ( Figura 5a ). Resolução satisfatória da estrutura e o tamanho bastante pequeno do conjunto de dados, essa heterogeneidade foi decidida como tolerável e, portanto, não foi realizada uma classificação 3D focalizada 23. Finalmente, a resolução local do mapa de densidade final foi calculada ( Etapa 9.1 do Protocolo , Figura 5b ) e o mapa 3D afiado foi filtrado localmente ( Passo 9.2 do protocolo ) Um volume dessa qualidade pode ser usado para o modelo de novo usando Coot 24 ou qualquer outra ferramenta de refinamento ( Figura 6 ). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Forte&gt; Figura 1: Processamento de Imagem usando SPHIRE. (A) A GUI do pacote de software SPHIRE. Uma etapa específica do fluxo de trabalho pode ser ativada selecionando o respectivo pictograma no lado esquerdo da GUI (&quot;etapa do fluxo de trabalho&quot;). Os comandos e utilitários associados a esta etapa do fluxo de trabalho aparecerão na área central da GUI. Depois de selecionar um dos comandos, os respectivos parâmetros são mostrados na área direita da GUI. Os parâmetros avançados normalmente não requerem a modificação dos valores predefinidos. ( B ) Estágios no fluxo de trabalho de processamento de imagem de uma única partícula usando a GUI SPHIRE. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Figura 2: Correção de Movimento e ParticExtracção. (A, b ) Micrografia digital de alta qualidade, de baixa dose, corrigida pela deriva, registrada em um defocus de 1,7 μm. Observe que os anéis de Thon isotrópicos estendem-se a uma resolução de 2,7 Å no espectro de potência (a) e as partículas bem discerníveis na imagem 2D ( b ). ( C ) Seleção de partículas usando e2boxer. Círculos verdes indicam partículas selecionadas. ( D ) Partículas brutas típicas extraídas da micrografia dose-ponderada. Barras de escala = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Figura 3: Agrupamento 2D e Geração Inicial do Modelo. (A) Galeria de médias de classe 2D, com a maioria representando vistas laterais<html> F da partícula. Barra de escala = 20 nm. ( B ) Ab initio mapa 3D de TcdA1 obtido usando RVIPER a partir das médias de classe livre de referência. ( C ) Encaixe do corpo rígido da estrutura cristalina TcdA1 (fitas) (pdb-id 1VW1) na densidade inicial de crio-EM (cinza transparente). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Figura 4: Estrutura 3D Cryo-EM de TcdA1. (A, b ) Mapa de densidade final de 3,5 Å de TcdA1 calculado usando ~ 9,500 imagens de partículas: ( a ) lado e ( b ) vista de cima. ( C ) ï¿½eas representativas da densidade cryo-EM para uma hï¿½ice α e uma p-folha.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Figura 5: Análise de Variabilidade e Resolução Local. (A) Superfície do mapa cryo-EM TcdA1 afiado (cinza) eo mapa de variabilidade (verde). Para maior clareza, o mapa de variabilidade foi filtrado por passagem baixa até 30 Å. ( B ) Representação superficial do mapa cryo-EM afiado TcdA1 corado de acordo com a resolução local (Å). Observe o acordo topológico entre áreas de alta variabilidade e baixa resolução local. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Figura 6: Modificação 3DConstrução de TcdA1 usando Coot. As regiões representativas da densidade crio-EM e o modelo atómico são mostrados para uma hélice a. O modelo atômico foi construído de novo usando Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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