Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Мы благодарим Д. Родерера за предоставление нам микроснимков TcdA1. Мы благодарим Стив Ладтке за постоянную поддержку инфраструктуры EMAN2. Эта работа была поддержана фондами Общества Макса Планка (SR) и Европейского Совета в рамках Седьмой рамочной программы Европейского союза (FP7 / 2007-2013) (грант № 615984) (СР) и гранта Национальных институтов Здоровье R01 GM60635 к PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

В последние годы криоэлектрик с одиночной частицей показал быстрое развитие и поставил многочисленные структуры атомного разрешения высокомолекулярных комплексов с большим биологическим значением 25 . Для поддержки большого числа начинающих пользователей, которые в настоящее время входят в поле, мы разработали платформу SPHIRE для анализа одиночных частиц и представили здесь сквозной протокол для всего рабочего процесса, включая выравнивание видео, подбор частиц, оценку CTF, исходную модель Расчет, 2D и 3D анализ неоднородности, 3D-анализ с высоким разрешением и локальное разрешение и фильтрацию. Описанный здесь протокол предназначен для краткого руководства по определению трехмерной структуры с использованием крио-ЭМ микроснимков представляющего интерес белка и с помощью вычислительных средств, предоставляемых автономным графическим интерфейсом SPHIRE. Главная особенность рабочего процесса состоит в том, что большинствоПроцедуры должны выполняться только один раз, поскольку они полагаются на концепцию валидации по воспроизводимости 19 и не требуют настройки параметров. Этот механизм автоматической проверки является основным преимуществом SPHIRE над другими программными пакетами, поскольку результаты, как правило, являются объективными, а также воспроизводимыми и, что наиболее важно, доступными при приемлемых вычислительных затратах. Кроме того, конвейер предоставляет обширную диагностическую информацию для опытных пользователей, чтобы провести независимую проверку и оценку собственными методами. Тем не менее, начинающий пользователь, обладающий, по крайней мере, элементарным теоретическим опытом в области структурной биологии и электронной микроскопии, должен иметь возможность получать структуры с почти атомарным разрешением, используя собственные данные и автоматизированные процедуры проверки. Однако получение структуры с почти атомарным разрешением не всегда просто, и результат будет в большой степени зависеть от качества образца и входного сигнала datа. Для процедур, представленных здесь, предполагается, что имеется достаточное количество высококачественных невыровненных необработанных фильмов ЭМ, при этом их средние величины показывают четко различимые однородные и случайно ориентированные одиночные частицы. В общем, нет никаких ограничений в отношении симметрии, размера или общей формы молекулы, но лимитирующим фактором может быть низкая молекулярная масса, особенно когда белок имеет безликую глобулярную форму. Обычно анализ более крупных, хорошо упорядоченных частиц с высокой симметрией в точечной группе менее требователен. Поэтому настоятельно рекомендуется начинающим пользователям сначала запустить настоящий протокол с хорошо охарактеризованным набором крио-EM. Либо учебные материалы SPHIRE (http: /sphire.mpg.de), либо один из наборов данных EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) с сырыми фильмами - хорошая отправная точка , При обработке собственных данных весьма вероятно, что некоторые наборы данных или некоторые из изображений не будут удовлетворять определенным требованиямКритериях. В этом контексте в дополнение к автоматическим проверкам стабильности и воспроизводимости, выполняемым программой для основных этапов рабочего процесса, все же рекомендуется для пользователей визуально проверять результаты на определенных «контрольных точках» протокола, особенно если окончательная реконструкция Не является удовлетворительным. Первый визуальный осмотр может быть выполнен на уровне микрофотографии после выравнивания видео ( протокол 2 ) и оценки CTF ( протокол 3 ). Полученные в результате скорректированные по движению средние значения должны демонстрировать четко различимые и хорошо разделенные отдельные частицы, и в их спектрах мощности должны быть четко различимы изотропные кольца Тона. Пространственная частота, на которую они видимы, в большинстве случаев определяет самое высокое разрешение, до которого в принципе может быть в конечном итоге определена структура. Примеры скорректированного с движением усреднения достаточного качества и его энергетического спектра показаны в разделе &amp; #34. Представительские результаты &quot;. Исчерпывающие изображения, которые могут оказать негативное влияние на конечный результат, могут быть удалены с помощью инструментов GUI для оценки Drift и CTF SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). Что касается скрининга частиц, решающим этапом в конвейере SPHIRE является 2D-классификация с использованием ISAC ( протокол этап 5.2) . Здесь пользователь должен контролировать, что воспроизводимые средние классы 2D, идентифицированные автоматически программой, принимают диапазон ориентации, достаточный для квазиравномерного покрытия углового пространства. Если качество средних классов не является удовлетворительным (шумные и / или размытые изображения) и / или число воспроизводимых средних значений очень невелико, рассмотрите возможность улучшения качества автоматического выбора, оптимизации создания набора данных или подготовки образца. В большинстве случаев невозможно вычислить надежную реконструкцию из набора данных, который не дает хорошие средние классы 2D. Примеры высококачественного пр-ва 2D-классаЯрости показаны в разделе «Представительские результаты». Для получения надежной исходной 3D-модели с использованием RVIPER в автоматическом режиме ( протокол Protocol 6.1 ) требуется по меньшей мере 100 средних классов. Для этого шага пользователь должен выбрать средние значения с самым высоким качеством и включить как можно больше различных ориентаций частицы. Качество исходной модели имеет решающее значение для успеха последующей 3D-обработки с высоким разрешением. В других пакетах программ иногда выполняется 3D-классификация для удаления «плохих» частиц 8 , 9 . Однако в SPHIRE большинство этих частиц автоматически устраняются уже при 2D классификации с использованием ISAC. Таким образом, рекомендуется выполнить интенсивный по вычислительной обработке шаг 3D-сортировки, только если реконструкция и анализ трехмерной изменчивости указывают на неоднородность набора данных. Самое главное, пользователь должен всегда тщательно проверять полученные трехмерные объемы ( протокол 9.3 ) и подтверждать, что характеристики соответствующей плотности хорошо согласуются с номинальным разрешением. При разрешении &lt;9 Å становятся видны стержнеобразные плотности, соответствующие α-спиралям. При разрешении &lt;4,5 Å плотности, соответствующие нитям в β-листах, обычно хорошо разделяются и становятся видимыми громоздкие аминокислоты. Карта высокого разрешения (&lt;3 Å) должна иметь четко различимые боковые цепи, что позволяет построить точную атомную модель. Полученные на сегодняшний день результаты демонстрируют, что с помощью тестов автоматической воспроизводимости SPHIRE и минимальных визуальных осмотров настоящий протокол, как правило, применим к любому типу одноэлектронного крио-ЭМ-проекта. Показаны репрезентативные результаты каждого этапа обработки для реконструкции токсина TcdA1Photorhabdus luminescens 21 , который был решен до почти атомарного разрешения. Карты плотностей аналогичного качества могут быть использованы для построения надежных атомных моделей путем трассировки магистральной сети de novo , а также для взаимного или реального уточнения пространства и, таким образом, обеспечивают прочную структурную основу для понимания сложных молекулярных механизмов. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОДЫ: Координаты для ЭМ-структуры и необработанных фильмов были помещены в Банк данных электронной микроскопии и Архив экспериментальной электронной микроскопии под номерами EMD-3645 и EMPIAR-10089 соответственно.

После разработки технологии прямого детектора электронов замечательный прогресс в криоэлектронике с одиночной частицей в настоящее время перестраивает структурную биологию 1 . По сравнению с рентгеновской кристаллографией этот метод требует лишь небольшого количества белкового материала без необходимости кристаллизации, одновременно создавая меньше ограничений по чистоте образца и все же позволяя определять структуры при близком атомном разрешении. Важно отметить, что различные составы или состояния теперь могут быть разделены вычислительно, и определение структуры различных конформаций может быть выполнено на беспрецедентном уровне детализации. В последнее время карты плотности сложных молекул могут быть получены при разрешениях, допускающих построение модели de novo и, следовательно, глубоком понимании их действия 2 , 3 , 4 , 5, Широкое разнообразие программных пакетов для обработки изображений доступно в сообществе 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), и большинство из них находятся в непрерывном развитии. Достигнута почти атомная разрешающая способность для белков, обладающих различными молекулярными массами и симметриями, с несколькими различными программными пакетами, включая EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 и SPARX 11 . Каждый пакет требует различного уровня знаний пользователей и обеспечивает другой уровень руководства пользователя, автоматизации и расширяемости. Более того, в то время как некоторые программы предоставляют полные среды для облегчения всех этапов анализа изображений, другие предназначены для оптимизации конкретных задач, таких как уточнение параметров выравнивания, начиная с известного rСтруктурная структура - мат. В последнее время было разработано несколько платформ, включая APPION 12 и SCIPION 13 , которые обеспечивают единый конвейер обработки данных, который объединяет подходы и протоколы из различных пакетов программного обеспечения, перечисленных выше. Чтобы внести свой вклад в текущую разработку крио-ЭМ, SPARX был переработан в новую самостоятельную и полную платформу для анализа одиночных частиц под названием SPHIRE (SPARX для электронной микроскопии высокого разрешения). Чтобы повысить доступность технологии для новых исследователей в этой области и справиться с большим объемом данных, получаемых с помощью современных полностью автоматизированных электронных микроскопов высокого класса, технологический конвейер был переработан и упрощен за счет введения простого в использовании Графический интерфейс пользователя (GUI) и автоматизация основных этапов рабочего процесса. Кроме того, были добавлены новые алгоритмы для быстрого, воспроизводимого и автоматического определения структуры от crYo-EM изображений. Кроме того, была введена валидация по воспроизводимости, чтобы избежать общих артефактов, возникающих в процессе уточнения и анализа неоднородности. Несмотря на то, что программа была широко изменена, поддерживались ее основные функции: прямой код с открытым исходным кодом, современный объектно-ориентированный дизайн и интерфейсы Python для всех основных функций. Таким образом, он не был изменен на программу черного ящика, что позволяет пользователям изучать и легко модифицировать код Python, создавать дополнительные приложения или изменять общий рабочий процесс. Это особенно полезно для нестандартных проектов крио-ЭМ. Здесь мы представляем протокол для получения карты плотности почти-атомного разрешения из крио-ЭМ изображений с использованием GUI SPHIRE. Он подробно описывает все этапы, необходимые для создания карты плотности из сырых крио-ЭМ фильмов прямого детектора и не ограничивается каким-либо конкретным типом макромолекул. Этот протокол в первую очередь предназначен для руководства newcOmers в поле через рабочий процесс и предоставить важную информацию об основных этапах обработки, а также некоторые из возможных ловушек и препятствий. Более подробные сведения и теоретические основы SPHIRE будут описаны в другом месте.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX для электронной микроскопии высокого разрешения) представляет собой новый программный пакет с открытым исходным кодом, удобный для полуавтоматической обработки данных одноэлектронной крио-микроскопии (крио-ЭМ). Представленный здесь протокол детально описывает, как получить близкую к атомному разрешению структуру, начиная с кинофильмов с крио-ЭМ-микроскопом, направляя пользователей на всех этапах контура определения структуры одной частицы. Этими шагами управляют из нового графического интерфейса пользователя SPHIRE и требуют минимального вмешательства пользователя. Используя этот протокол, структура 3.5 Tc TcdA1, комплекса Tc-токсина от Photorhabdus luminescens , была получена только из 9500 отдельных частиц. Этот оптимизированный подход поможет начинающим пользователям без обширного опыта обработки и априорной структурной информации получить бесшумные и беспристрастные атомные модели их очищенных макромолекулярных комплексов в их собственном состоянии.

<html> Описанный выше протокол выполнялся, начиная с 112 прямых фильмов детектора компонента А комплекса Tchc1 ( Photonhabdus luminescens Tc) (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Этот набор данных был записан на Cs-скорректированном электронном крио-микроскопе с высокояркой полевой эмиссионной пушкой (XFEG), работающей при ускоряющем напряжении 300 кВ. Изображения были получены автоматически с общей дозой 60 e - / Å -2 при размере пикселя 1,14 Å в масштабе образца. После выравнивания кадров кинофильма ( этап 2 протокола) полученные в результате движения скорректированные средние значения имели изотропные кольца Тона, простирающиеся до высокого разрешения ( рис. 2а ). Отдельные частицы были хорошо видны и хорошо разделены ( рис. 2b ). Частицы затем собирали с помощью инструмента swarm e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( этап протокола 4.1 ). В этом случае соответствующий порог был установлен с использованием более селективного варианта ( рисунок 2c ). 112 цифровых микрофотографий дали 9 652 частицы. Большинство извлеченных изображений ( этап протокола 4.2 ) содержало четко определенные частицы, и размер их ящиков был ~ 1.5 раза больше, чем размер частиц, как рекомендовалось ( рисунок 2d ). Затем, используя ISAC, был выполнен 2D анализ неоднородности ( Протокол 5 ). Это дало средние 98 классов ( Рисунок 3a ). Используя эти средние классы 2D, модель ab initio была рассчитана с использованием VIPER ( протокол Step 6 ) при промежуточном разрешении ( рис. 3b ). Эта модель демонстрирует превосходное согласие с кристаллической структурой TcdA1, ранее решённой при 3.9 Å резолюции 22 ( рис. 3c ). Эта модель ab initio использовалась в качестве начальной температуры<html> Пластины для 3D-уточнения (MERIDIEN), что дает 3.5 A (0,143 критерия) реконструкцию ( протокол Step 7 ) только из ~ 40 000 асимметричных единиц ( рисунок 4 ). Эта карта близкого к атомному разрешению была получена за 24 часа, используя до 96 процессоров для шагов рабочего процесса, которые выигрывают от нескольких ядер. Для анализа трехмерной изменчивости (шаг протокола 8) на этапе 8.3.3 использовалось только 2000 изображений частиц в каждой группе ( т.е. процесс начинается с 5 исходных трехмерных групп) и 200 изображений для наименьшего размера группы на этапе 8.3.4 из-за Небольшое количество частиц (~ 10000). Анализ показал локализованную гибкость, главным образом, в N-концевой области комплекса, который содержит метку His, используемую для очистки ( фиг.5а ). Действительно, двенадцать N-концевых остатков и His-метка не были разрешены в ранее опубликованной кристаллической структуре TcdA1&quot;&gt; 22, и этот, по-видимому, беспорядочный район остался неразрешенным в существующей плотности крио-ЭМ, вероятно из-за его гибкости. Была обнаружена дополнительная изменчивость в рецептор-связывающих доменах и BC-связывающем домене ( рис. 5а ). Удовлетворительного разрешения структуры и относительно небольшого размера набора данных эта гетерогенность была признана приемлемой и, следовательно, не была выполнена сфокусированная 3D-классификация 23. Наконец, было вычислено локальное разрешение окончательной карты плотности ( протокол 9.1, рисунок 5b ), и заточенная 3D-карта была локально отфильтрована ( протокол 9.2) . Объем этого качества может быть использован для создания новой модели с использованием Coot 24 или любого другого инструмента уточнения ( рисунок 6 ). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; Рисунок 1: Обработка изображений с использованием SPHIRE. ( A ) GUI программного пакета SPHIRE. Определенный этап рабочего процесса можно активировать, выбрав соответствующую пиктограмму в левой части графического интерфейса («шаг рабочего процесса»). Команды и утилиты, связанные с этим шагом рабочего процесса, будут отображаться в центральной области графического интерфейса. После выбора одной из команд соответствующие параметры отображаются в правой области графического интерфейса. Расширенные параметры обычно не требуют изменения предустановленных значений по умолчанию. ( B ) Этапы рабочего процесса обработки одиночных изображений с использованием графического интерфейса SPHIRE. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Рисунок 2: Коррекция движения и ParticИзвлечение. ( A , b ) Типичная цифровая микрофотография с высоким разрешением, с низкой дозой, с коррекцией дрейфа, записанная при расфокусировке 1,7 мкм. Обратите внимание на изотропные кольца Тона, простирающиеся до разрешения 2,7 Å в спектре мощности (a) и хорошо различимые частицы на двумерном изображении ( b ). ( C ) Выбор частиц с помощью e2boxer. Зеленые круги указывают выбранные частицы. ( D ) Типичные необработанные частицы, извлеченные из взвешенной дозы микрофотографии. Шкала шкалы = 20 нм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Рисунок 3: 2D-кластеризация и создание исходной модели. ( A ) Галерея средних значений 2D-класса, большинство из которых представляют виды сбоку o<html> Частица. Шкала шкалы = 20 нм. ( B ) Ab initio 3D-карта TcdA1, полученная с использованием RVIPER, от средних значений без ссылки. ( C ) Подгонка жесткой структуры кристаллической структуры TcdA1 (ленты) (pdb-id 1VW1) в начальную плотность крио-ЭМ (прозрачная серая). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Рисунок 4: Cryo-EM 3D-структура TcdA1. ( A , b ) Окончательная карта плотности 3,5 TcdA1, рассчитанная с использованием ~ 9500 изображений частиц: ( a ) сторона и ( b ) вид сверху. ( C ) Репрезентативные области плотности крио-ЭМ для α-спирали и β-листа.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. <img alt="Рисунок 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Рисунок 5: Анализ изменчивости и локальное разрешение. ( A ) Поверхность заостренной крио-EM карты TcdA1 (серая) и карта изменчивости (зеленая). Для большей наглядности карта изменчивости была фильтром нижних частот до 30 Å. ( B ) Поверхностный рендеринг заостренной крио-EM карты TcdA1, окрашенной в соответствии с местным разрешением (Å). Обратите внимание на топологическое согласие между областями высокой изменчивости и низким локальным разрешением. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a> <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Рисунок 6: 3D-моделированиеEl Здание TcdA1 с использованием Coot. Для α-спирали показаны репрезентативные области плотности крио-ЭМ и атомная модель. Атомная модель была построена de novo с использованием Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

В настоящем документе представлен протокол обработки крио-ЭМ изображений с использованием программного комплекса SPHIRE. Настоящий протокол может быть применен практически для всех одномерных ЭМ-проектов, нацеленных на решение задач с атомным разрешением.

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Высокое разрешение Комплекс Профилирование криосликинг BN-MS Анализ

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Крио-ЭМ и анализ одиночных частиц с помощью Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Криоэлектронная микроскопия с одной частицей: от образца к структуре

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Ручное замораживание биологических образцов для одночастичной криогенной электронной микроскопии

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Усовершенствование визуализации вирусных сборок с высоким разрешением в жидкости и льду

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...