Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Vi tackar D. Roderer för att ge oss TcdA1-mikrografer. Vi tackar Steve Ludtke för hans pågående stöd för EMAN2-infrastrukturen. Detta arbete stöddes av medel från Max Planck Society (till SR) och Europeiska rådet under Europeiska unionens sjunde ramprogram (RP7 / 2007-2013) (bidrag nr 615984) (till SR) och bidrag från National Institutes of Hälsa R01 GM60635 till PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Enkeltpartikelkryo-EM har visat en snabb utveckling under de senaste åren och levererat många atomupplösningsstrukturer av makromolekylära komplex med stor biologisk betydelse 25 . För att stödja det stora antalet nybörjare som går in i fältet utvecklade vi enhetspartikelbildanalysplattformen SPHIRE och presenterar här ett genomgångsprotokoll för hela arbetsflödet inklusive filmjustering, partikelplockning, CTF-estimering, första modell Beräkning, 2D och 3D heterogenitetsanalys, 3D-raffinering med hög upplösning och lokal upplösning uppskattning och filtrering. Protokollet som beskrivs här är avsett som en kort guide till 3D-strukturbestämning med användning av cryo-EM-mikrografer av proteinet av intresse och med hjälp av beräkningsverktyg som tillhandahålls av SPHIREs fristående GUI. Huvuddelen av arbetsflödet är det mestaAv förfarandena behöver endast köras en gång, eftersom de bygger på begreppet validering genom reproducerbarhet 19 och kräver inte parameterjustering. Denna automatiska valideringsmekanism är en viktig fördel med SPHIRE jämfört med andra mjukvarupaket, eftersom resultaten tenderar att vara objektiva såväl som reproducerbara och, viktigast av allt, erhållas till en acceptabel beräkningskostnad. Rörledningen ger dessutom en mängd diagnostisk information för erfarna användare att genomföra ytterligare oberoende validering och bedömning med egna metoder. Ändå bör en nybörjare som har åtminstone elementär teoretisk bakgrund i strukturell biologi och elektronmikroskopi kunna erhålla strukturer med näratomisk upplösning med egen data och de automatiserade valideringsprocedurerna. Att erhålla en närbildsupplösningsstruktur är emellertid inte alltid okomplicerad och resultatet kommer mycket att bero på provets kvalitet och ingångsdatanen. För de förfaranden som presenteras här antas det att ett tillräckligt antal högkvalitativa, oanpassade råa EM-filmer är tillgängliga, med deras medelvärden som visar klart urskiljbara homogena och slumpmässigt orienterade enskilda partiklar. Generellt finns det inga restriktioner vad gäller symmetri, storlek eller övergripande form av molekylen, men en låg molekylvikt kan vara en begränsande faktor, speciellt när proteinet har en featurlös globform. Vanligtvis är analys av större, välbeställda partiklar med högpunktsgruppsymmetri mindre krävande. Det är därför starkt rekommenderat för nybörjare att köra nuvarande protokoll först med en välkänd cryo-EM dataset. Antingen SPHIRE handledning data (http: /sphire.mpg.de) eller en av EMPIAR inlämnade dataset (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råa filmer är en bra utgångspunkt . Vid bearbetning av egna data är det mycket troligt att vissa dataset eller några bilder inte uppfyller vissa kvalifikationerTy kriterier. I det här sammanhanget, förutom de automatiska stabilitets- och reproducerbarhetskontrollerna som utförs av programmet för stora steg i arbetsflödet, rekommenderas det fortfarande att användarna visuellt inspekterar resultaten vid vissa &quot;kontrollpunkter&quot; i protokollet, särskilt om den slutliga återuppbyggnaden Är inte tillfredsställande. Den första visuella inspektionen kan utföras på mikrografnivå efter filminriktningen (protokollsteg 2 ) och CTF-estimeringen (protokollsteg 3 ). De resulterande rörelsereglerade medelvärdena bör tydligt urskilja och separerade enskilda partiklar och deras effektspektra bör visa klart urskiljbara, isotropa Thon-ringar. Den rumsliga frekvensen som de är synliga definierar i de flesta fall den högsta upplösningen som strukturen i princip i slutändan kan bestämmas. Exempel på ett rörelsekorrigerat medelvärde av tillräcklig kvalitet och dess effektspektrum visas i avsnittet &amp; #34; Representativa resultat. &quot;Utgående bilder som kan ha negativ inverkan på slutresultatet kan avlägsnas med hjälp av SPHIREs GUI-verktyg för drift och CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). När det gäller partikelskärmning är det avgörande steget i SPHIRE-rörledningen 2D-klassificeringen med användning av ISAC (protokollsteg 5.2) . Här bör användaren kontrollera att de reproducerbara 2D-klassernas medelvärden identifieras automatiskt genom att programmet antar en rad orienteringar som är tillräckliga för att kvasi jämnt täcka vinkelutrymmet. Om kvaliteten på klassens medelvärden inte är tillfredsställande (bullriga och / eller suddiga bilder) och / eller antalet reproducerbara klassmedelvärden är mycket lågt, överväga att förbättra automatisk plockningskvalitet, optimera datasetbilder eller provberedning. I de flesta fall är det inte möjligt att beräkna en tillförlitlig rekonstruktion från en dataset som inte ger bra 2D-klassmedelvärden. Exempel på högkvalitativ 2D-klass aveRaser visas i avsnittet &quot;Representativa resultat&quot;. Minst 100 klassmedelvärden krävs för att få en pålitlig initial 3D-modell med RVIPER på ett automatiserat sätt (protokoll steg 6.1 ). För detta steg ska användaren välja medelvärden med högsta kvalitet och inkludera så många olika orienteringar av partikeln som möjligt. Kvaliteten på den ursprungliga modellen är avgörande för framgången för den efterföljande 3D-raffineringen med hög upplösning. I andra mjukvarupaket görs 3D klassificering ibland för att ta bort &quot;dåliga&quot; partiklar 8 , 9 . I SPHIRE elimineras emellertid de flesta av dessa partiklar automatiskt redan under 2D-klassificering med ISAC. Således rekommenderas det att utföra det beräkningsintensiva steget för 3D-sortering endast om rekonstruktionen och 3D-variabilitetsanalysen indikerar heterogenitet i datasetet. Viktigast av allt bör användaren noggrant inspektera de resulterande 3D-volymerna noggrant (protokoll steg 9.3 ) och bekräfta att egenskaperna hos respektive densitet överensstämmer väl med den nominella upplösningen. Vid en upplösning av &lt;9 Å blir stavliknande densiteter som motsvarar a-helixer synliga. Vid en upplösning &lt;4,5 Å är densiteter som motsvarar strängar i p-ark normalt väl separerade och skrymmande aminosyror blir synliga. En kartong med hög upplösning (&lt;3 Å) ska visa tydligt urskiljbara sidokedjor, vilket möjliggör byggandet av en exakt atommodell. Resultat som hittills erhållits visar att det här protokollet i allmänhet är tillämpligt på alla typer av enkelpartikel-kryo-EM-projekt, med hjälp av SPHIREs automatiska reproducerbarhetstest och minimala visuella inspektioner. Representativa resultat av varje behandlingssteg visas för rekonstruktionen av TcdA1-toxinet avPhotorhabdus luminescens 21 , som har lösts till nära atomisk upplösning. Densitetskartor av liknande kvalitet kan användas för att konstruera tillförlitliga atommodeller genom de novo ryggradsspårning samt ömsesidig eller verklig rymdförädling och därigenom ge en solid strukturell ram för förståelse av komplexa molekylära mekanismer. Tillskottskoder: Koordinaterna för EM-strukturen och de obearbetade filmerna har deponerats i elektronmikroskopibildbanken och elektronmikroskopipilotbildarkivet enligt anslutningsnummer EMD-3645 respektive EMPIAR-10089.

Efter utvecklingen av direktelektrondetektortekniken omformar den anmärkningsvärda framstegen i single particle cryo-EM för närvarande strukturella biologi 1 . Jämfört med röntgenkristallografi kräver denna teknik endast en liten mängd proteinmaterial utan behov av kristallisation, samtidigt som det ställer färre restriktioner avseende provets renhet och tillåter fortfarande bestämning av strukturer vid näratomisk upplösning. Viktigt är att olika kompositioner eller tillstånd nu kan beräknas separeras från varandra och strukturbestämning av de olika konformationerna kan utföras vid en aldrig tidigare skådad detaljnivå. Nyligen kunde täthetskartor av utmanande molekyler framställas vid resolutioner som möjliggjorde de novo modellbyggnad och därigenom djup förståelse av deras handlingssätt 2 , 3 , 4 , 5. Ett brett utbud av programvarupaket för bildbehandling finns i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samhället (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) och de flesta av dem är under kontinuerlig utveckling. Nära atomupplösning har uppnåtts för proteiner som uppvisar olika molekylvikter och symmetrier med flera olika mjukvarupaket, inklusive EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 och SPARX 11 . Varje paket kräver en annan nivå av användarkunskap och ger en annan nivå av användarvägledning, automatisering och utökningsbarhet. Dessutom, medan vissa program ger fullständiga miljöer för att underlätta alla steg med bildanalys, är andra utformade för att optimera specifika uppgifter, såsom förfining av anpassningsparametrar som börjar från en känd rFördelstruktur. Mer nyligen har flera plattformar utvecklats, inklusive APPION 12 och SCIPION 13 , som tillhandahåller en enda bearbetningsrörledning som integrerar tillvägagångssätt och protokoll från de olika mjukvarupaket som anges ovan. För att bidra till den nuvarande utvecklingen av kryo-EM, utvecklades SPARX till en ny fristående och komplett plattform för enkelpartikelanalys, kallad SPHIRE (SPARX för högupplösande elektronmikroskopi). För att öka tillgängligheten till tekniken för nya forskare inom fältet och hantera den stora mängd data som produceras av moderna helautomatiska avancerade elektronmikroskop, redigerades och förenklades bearbetningsrörledningen genom att introducera en enkel att använda Grafiskt användargränssnitt (GUI) och automatisering av de viktigaste stegen i arbetsflödet. Dessutom tillsattes nya algoritmer för att tillåta snabb, reproducerbar och automatiserad strukturbestämning från crYo-EM-bilder. Vidare infördes validering genom reproducerbarhet för att undvika vanliga artefakter producerade under förfining och heterogenitetsanalys. Även om programmet var omfattande modifierat, behölls dess uppskattade kärnfunktioner: enkel öppen källkod, den moderna objektorienterade designen och Python-gränssnittet för alla grundläggande funktioner. Således blev det inte ändrat till ett svart lådprogram, vilket gör det möjligt för användare att studera och enkelt modifiera Python-koden, skapa ytterligare applikationer eller ändra det övergripande arbetsflödet. Detta är särskilt användbart för icke-standardiserade cryo-EM-projekt. Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla en nära-atomisk upplösningstäthetskarta från cryo-EM-bilder med hjälp av GUI av SPHIRE. Det beskriver i detalj alla steg som krävs för att generera en täthetskarta från råcryo-EM direktdetektorfilmer och är inte begränsad till någon speciell makromolekyltyp. Detta protokoll avser främst att styra newcOmers i fältet genom arbetsflödet och ge viktig information om viktiga steg i behandlingen samt några av de möjliga fallgroparna och hindren. Mer avancerade funktioner och den teoretiska bakgrunden bakom SPHIRE kommer att beskrivas någon annanstans.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX för högupplösande elektronmikroskopi) är en ny öppen källkod, användarvänlig mjukvarusupport för halvautomatiserad behandling av data med enkelpartikelelektronkryo-mikroskopi (cryo-EM). Protokollet som presenteras här beskriver i detalj hur man erhåller en närbildsupplösningsstruktur som startar från cryo-EM mikrograph-filmer genom att styra användarna genom alla steg i bestämningsrörledningen för enkelpartikelstruktur. Dessa steg styrs från det nya grafiska användargränssnittet SPHIRE och kräver minst användarintervention. Med användning av detta protokoll härleddes en 3,5 Å-struktur av TcdAl, ett Tc- toxinkomplex från Photorhabdus luminescens , från endast 9500 enskilda partiklar. Detta strömlinjeformade tillvägagångssätt kommer att hjälpa nybörjare utan omfattande behandlingserfarenhet och a priori strukturell information, för att erhålla bullerfria och opartiska atommodeller av sina renade makromolekylära komplex i sitt ursprungsland.

<html> Protokollet som beskrivits ovan utfördes från 112 direktdetektorfilmer av A-komponenten i Photorhabdus luminescens Tc-komplexet (TcdAl) 20 , 21 , 22 . Denna dataset spelades in på ett Cs-korrigerat elektronkryo-mikroskop med en hög ljusstyrkafältutsläppspistol (XFEG), som drivs vid en accelerationsspänning på 300 kV. Bilderna förvärvades automatiskt med en total dos av 60 e - / Å -2 vid en pixelstorlek på 1,14 Å på provskalan. Efter anpassning av filmramarna (Protokollsteg 2 ) hade de resulterande rörelsereglerade medelvärdena isotropa Thonringar som sträcker sig till högupplösning ( Figur 2a ). De enskilda partiklarna var lätt synliga och väl separerade ( figur 2b ). Partiklar plockades sedan med hjälp av svärmverktyget för e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( protokoll steg 4.1 ). I detta fall fastställdes ett lämpligt tröskelvärde med hjälp av det mer selektiva alternativet ( Figur 2c ). De 112 digitala mikrograferna gav 9 652 partiklar. Majoriteten av de extraherade bilderna (protokollsteg 4.2 ) innehöll väldefinierade partiklar och deras lådstorlek var ~ 1,5 gånger större än partikelstorleken, såsom rekommenderas ( Figur 2d ). Därefter utfördes en 2D-heterogenitetsanalys med hjälp av ISAC (protokoll steg 5 ). Det gav 98 klassmedelvärden ( figur 3a ). Med hjälp av dessa 2D-klassmedelvärden beräknades en ab initio- modell med användning av VIPER (protokoll steg 6 ) vid mellanupplösning ( figur 3b ). Denna modell visar utmärkt överenskommelse med kristallstrukturen hos TcdA1 som tidigare lösts vid 3,9 Å-upplösning 22 ( Figur 3c ). Denna ab initio- modell användes som ett inledande temp<html> Plattan för 3D-raffinement (MERIDIEN), vilket ger en rekonstruktion på 3,5 Å (0,143 kriterium) (Protokoll steg 7 ) från endast ~ 40 000 asymmetriska enheter ( Figur 4 ). Denna karta med nära atomisk upplösning erhölls inom 24 timmar, med användning av upp till 96 processorer för stegen i arbetsflödet som drar nytta av flera kärnor. För 3D-variabilitetsanalysen ( protokollsteg 8) användes endast 2000 partikelbilder per grupp i steg 8.3.3 ( dvs processen startar med 5 initiala 3D-grupper) och 200 bilder för den minsta gruppstorleken i steg 8.3.4 på grund av Det lilla antalet partiklar (~ 10 000). Analysen avslöjade lokaliserad flexibilitet huvudsakligen vid det komplexa N-terminala regionen som innehåller His-märket som användes för rening ( Figur 5a ). I själva verket upplöstes tolv N-terminala rester och His-taggen inte i den tidigare publicerade kristallstrukturen av TcdA1&quot;&gt; 22 och denna förmodligen oordnade regionen förblev oupplösad i föreliggande cryo-EM-densitet, troligen på grund av dess flexibilitet. Ytterligare variabilitet detekterades vid receptorbindningsdomänerna och BC-bindningsdomänen ( Figur 5a ). På grund av det totala Tillfredsställande upplösning av strukturen och den relativt små storleken av datasetet, bestämdes denna heterogenitet att vara tolerabel och därför utfördes inte en fokuserad 3D-klassificering 23. Slutligen beräknades den lokala upplösningen av den slutliga densitetskartan (protokoll steg 9.1, figur 5b ) och den skärpa 3D-kartan filtrerades lokalt (protokoll steg 9.2) . En volym av denna kvalitet kan användas för de novo modellbyggnad med användning av Coot 24 eller något annat förädlingsverktyg ( Figur 6 ). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Stark&gt; Figur 1: Bildbehandling med SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE-programvarupaketet. Ett specifikt steg i arbetsflödet kan aktiveras genom att välja respektive piktogram på vänster sida av GUI (&quot;arbetsflödessteg&quot;). Kommandon och verktyg som är associerade med detta steg i arbetsflödet visas i det centrala området av GUI. Efter att ha valt en av kommandona visas respektive parametrar i den högra delen av GUI. Avancerade parametrar behöver vanligtvis inte ändra de förinställda standardvärdena. ( B ) Steg i arbetsflödet för enkelpartikelbildbehandling med hjälp av SPHIRE GUI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Figur 2: Motion Correction och ParticLe extraktion. ( A , b ) Typisk högkvalitativ, lågdos, driftskorrigerad digital mikrograph inspelad vid en defokus på 1,7 μm. Notera att de isotropa Thon ringarna sträcker sig till en upplösning på 2,7 Å i effektspektrumet (a) och de välkännbara partiklarna i 2D-bilden ( b ). ( C ) Partikelval med användning av e2boxer. Gröna cirklar indikerar valda partiklar. ( D ) Typiska råpartiklar extraherade från den dosviktade mikrografen. Skalstänger = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Figur 3: 2D Clustering och Initial Model Generation. ( A ) Galleri med 2D klassmedelvärden, med majoriteten representerande sidovyer o<html> F partikeln. Skala bar = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-karta över TcdA1 erhållen med RVIPER från referensfria klassmedelvärdena. ( C ) Rigidkroppsanpassning av TcdA1-kristallstrukturen (band) (pdb-id 1VW1) i den ursprungliga cryo-EM-densiteten (transparent grå). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Figur 4: Cryo-EM 3D-struktur av TcdA1. ( A , b ) Slutlig 3,5 Å täthetskarta över TcdA1 beräknad med ~ 9 500 partikelbilder: ( a ) sida och ( b ) toppvy. C ) Representativa områden av cryo-EM-densiteten för en a-helix och en p-ark.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Figur 5: Variabilitetsanalys och lokal upplösning. ( A ) Ytan på den skärpa TcdA1 cryo-EM-kartan (grå) och variabilitetskortet (grönt). För bättre klarhet filtrerades variabelkartan med lågpassfiltret till 30 Å. ( B ) Ytbehandling av TcdA1-skärpad cryo-EM-kartan färgad enligt lokal upplösning (Å). Notera det topologiska avtalet mellan områden med hög variabilitet och låg lokal upplösning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Figur 6: 3D ModEl Byggande av TcdA1 med användning av Coot. Representativa regioner av kryo-EM-densiteten och atommodellen visas för en a-helix. Atommodellen byggdes de novo med Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

I detta papper presenteras ett protokoll för bearbetning av cryo-EM-bilder med hjälp av programvarupaketet SPHIRE. Det föreliggande protokollet kan tillämpas för nästan alla enskilda partikel-EM-projekt som riktar sig mot när-atomupplösning.

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Högupplöst Complexome-profilering genom att Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Single Particle Cryo-Electron Mikroskopi: Från prov till struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuell Blot-and-Plunge frysning av biologiska exemplar för enpartikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ett robust arbetsflöde för bearbetning av kryo-elektronmikroskopi med en partikel (kryo-EM) med kryoSPARC, RELION och Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Främja högupplöst avbildning av virusaggregat i vätska och is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...