Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Bize TcdA1 mikrografları sağladığı için D. Roderer&#39;a teşekkür ediyoruz. Steven Ludtke&#39;ye EMAN2 altyapısının devam eden desteği için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Max Planck Topluluğu&#39;ndan (SR&#39;ye) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) (615984 no&#39;lu hibeye kadar) Avrupa Konseyi&#39;ne (SR&#39;ye) ve Ulusal Enstitülerden Sağlık R01 GM60635 ila PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Tek parçacıklı cryo-EM, son yıllarda hızlı bir gelişme göstermiş ve büyük biyolojik önemi olan makromoleküler komplekslerin sayısız atomik çözünürlük yapıları üretmiştir25. Şu anda sahaya giren çok sayıda acemi kullanıcısını desteklemek için tek parçacıklı görüntü analiz platformu SPHIRE&#39;yi geliştirdik ve burada film hizalama, parçacık toplama, CTF tahmini, başlangıç ​​modeli dahil olmak üzere tüm iş akışları için bir walk-through protokolü sunduk Hesaplama, 2D ve 3D heterojenite analizi, yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirme ve yerel çözünürlük tahmini ve filtreleme. Burada açıklanan protokol, ilgilenilen proteinin cryo-EM mikrograflarını kullanarak ve SPHIRE&#39;nin tek başına GUI tarafından sağlanan hesaplama araçlarının yardımıyla, 3B yapı tayini için kısa bir rehber olarak tasarlanmıştır. İş akışının en önemli özelliği,Prosedürlerin tekrarlanabilirlik 19 ile geçerlilik kavramına dayandığı ve parametre ayarlamasına ihtiyaç duymadığı için yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir. Bu otomatik validasyon mekanizması, SPHERE&#39;nin diğer yazılım paketlerine kıyasla önemli bir avantajıdır; çünkü sonuçlar, nesnel olabilmeleri ve çoğaltılabilir olmaları ve daha da önemlisi, kabul edilebilir bir hesaplama maliyetiyle elde edilebilir olma eğilimindedirler. Boru hattı ayrıca deneyimli kullanıcılar için kendi yöntemleriyle bağımsız bağımsız doğrulama ve değerlendirme yapmak için zengin bir teşhis bilgisi sağlar. Yine de, yapısal biyoloji ve elektron mikroskobunda en azından temel teorik altyapıya sahip olan bir acemi kullanıcı, kendi verileri ve otomatik validasyon prosedürleri kullanarak atom-altı çözünürlük yapıları elde edebilmelidir. Bununla birlikte, atom-altı bir çözünürlük yapısının elde edilmesi her zaman açık değildir ve sonuç, numunenin kalitesine ve giriş verilerine bağlıdıra. Burada sunulan prosedürler için, yeterli sayıda homojen ve rastgele yönlendirilmiş tek parçacıklar gösteren ortalama yüksek kaliteli, hizalanmamış ham EM filmleri bulunduğunu varsaymaktadır. Genel olarak, simetri, boyut veya molekülün genel şekli ile ilgili herhangi bir kısıtlama yoktur, ancak düşük moleküler ağırlık, özellikle protein şekilsiz küresel şekle sahip olduğunda, sınırlayıcı bir faktör olabilir. Genellikle, yüksek nokta grubu simetrisi ile daha büyük, iyi düzenlenmiş parçacıkların analizi daha az talep gerektirir. Bu nedenle acemi kullanıcıların mevcut protokolü önce iyi karakterize edilmiş bir cryo-EM veri setiyle çalıştırmaları kesinlikle önerilir. Ya SPHIRE öğretici veriler (http: /sphire.mpg.de) veya ham filmlerle EMPIAR tarafından sunulan veri kümelerinden (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) biri iyi bir başlangıç ​​noktasıdır . Kendi verilerinizi işlerken, bazı veri kümelerinin veya bazı resimlerin bazı quali&#39;yi karşılamayacağı muhtemeldirKriterleri. Bu bağlamda, iş akışının büyük adımları için program tarafından gerçekleştirilen otomatik kararlılık ve tekrarlanabilirlik kontrollerine ek olarak, kullanıcıların protokolün belirli &quot;kontrol noktalarında&quot; sonuçlarını görsel olarak incelemesi önerilir, özellikle de son yeniden yapılanma Tatmin edici değil. İlk görsel muayene, film hizalamasından ( Protokol adımı 2 ) ve CTF tahmini sonrasında ( protokol adım 3 ) mikrograf düzleminde yapılabilir. Ortaya çıkan hareket düzeltilmiş ortalamalar açıkça ayırt edilebilir ve iyi ayrılmış tek parçacıklar göstermeli ve güç tayfları açıkça görülebilir, izotropik Thon halkaları göstermelidir. Görünür oldukları mekansal frekans, çoğu durumda, yapının ilke olarak nihai olarak belirleyebileceği en yüksek çözünürlüğü tanımlar. Hareket düzeltilmiş yeterli kalitede ve güç tayfı ortalamasına örnekler,34; Temsilcilik Sonuçları &quot;Son sonuca olumsuz etkisi olabilecek outlier görüntüler, SPHIRE&#39;nin Drift ve CTF değerlendirme GUI araçlarıyla (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) kaldırılabilir. Parçacık taramasıyla ilgili olarak, SPHIRE boru hattındaki önemli adım, ISAC&#39;yi kullanarak 2D sınıflandırmadır ( Protokol Adımı 5.2) . Burada, kullanıcı, program tarafından otomatik olarak tanımlanan yeniden üretilebilir 2D sınıf ortalamalarının, açısal alanı tamamen eşit şekilde örtmek için yeterli bir oryantasyon aralığını benimsemesini kontrol etmelidir. Sınıf ortalamaları kalitesi tatmin edici değilse (gürültülü ve / veya bulanık görüntüler) ve / veya tekrarlanabilir sınıf ortalamaları çok düşükse, otomatik toplama kalitesini iyileştirmeyi, veri kümesi görüntülemeyi veya örnek hazırlamayı optimize etmeyi düşünün. Çoğu durumda, iyi bir 2D sınıf ortalamaları sağlamayan bir veri kümesinden güvenilir bir yeniden yapılandırma hesaplamak mümkün değildir. Yüksek kaliteli 2D sınıf ave örnekleri&quot;Temsilci Sonuçlar&quot; bölümünde gösterilmektedir. RVIPER kullanarak otomatik bir şekilde güvenilir bir başlangıç ​​3D modeli elde etmek için en az 100 sınıf ortalaması gereklidir ( Protokol Adımı 6.1 ). Bu adım için, kullanıcı en yüksek kalitede ortalamaları seçmeli ve parçacığın mümkün olduğunca çok yönünü içermelidir. İlk modelin kalitesi, sonraki yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirmenin başarısı için kritik önem taşıyor. Diğer yazılım paketlerinde, &quot;kötü&quot; parçacıkları 8 , 9 kaldırmak için bazen 3D sınıflandırma yapılır. Bununla birlikte, SPHIRE&#39;de bu parçacıkların çoğu, ISAC kullanılarak 2D sınıflandırma sırasında otomatik olarak elimine edilir. Bu nedenle, 3D sıralama işleminin yoğun bir adımını gerçekleştirmek için yeniden yapılandırma ve 3D değişkenlik analizi, veri kümesinin heterojenliğini gösteriyorsa önerilir. En önemlisi, kullanıcı her zaman ortaya çıkan 3B birimlerini dikkatli bir şekilde dikkatlice kontrol etmeli ( Protokol adımı 9.3 ) ve ilgili yoğunluğun özelliklerinin nominal çözünürlük ile iyi uyduğunu onaylamalıdır. &lt;9Å çözünürlüğünde, α-helislere karşılık gelen çubuk benzeri yoğunluklar görülebilir hale gelir. &lt;4.5 Å çözünürlükte, β-tabakalarındaki ipliklere karşılık gelen yoğunluklar normalde iyi ayrılır ve hacimli amino asitler görünür hale gelir. Yüksek çözünürlüklü bir harita (&lt;3 Å) açıkça görülebilir yan zincirler göstermeli ve böylece doğru bir atom modelinin oluşturulmasına izin verilmelidir. Bugüne kadar elde edilen sonuçlar, SPHERE&#39;nin otomatik tekrarlanabilirlik testleri ve minimal görsel incelemelerin yardımıyla, mevcut protokolün her türden tek parçacıklı cryo-EM projesine uygulanabileceğini göstermektedir. Her işleme adımının temsili sonuçları, TcdA1 toksininin yeniden yapılandırılması için gösterilir.Photorhabdus luminescens 21 , atomik çözünürlük yakınında çözülmüştür. Benzer nitelikteki yoğunluk haritaları, de novo omurga izlemenin yanı sıra karşılıklı veya gerçek uzay arıtma yöntemiyle güvenilir atom modelleri oluşturmak ve böylece karmaşık moleküler mekanizmaların anlaşılması için sağlam bir yapısal çerçeve sağlamak için kullanılabilir. ACCESION KODLARI: EM yapısının ve işlenmemiş filmlerin koordinatları sırasıyla EMD-3645 ve EMPIAR-10089 erişim numaraları altında Elektron Mikroskopisi Veri Bankası&#39;na ve Elektron Mikroskopisi Pilot Görüntü Arşivi&#39;ne yatırıldı.

Doğrudan elektron dedektörü teknolojisinin gelişmesinden sonra, tek parçacık kriyo-EM&#39;deki dikkate değer ilerleme şu anda yapısal biyolojiyi yeniden şekillendirmektedir 1 . X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bu teknik, kristalizasyona gerek duymadan az miktarda protein materyali gerektirirken, aynı zamanda numunenin saflığı konusunda daha az kısıtlama getirmekte ve yine atomik çözünürlük yakınında yapıların belirlenmesine izin vermektedir. Önemlisi, şimdi farklı kompozisyonlar veya durumlar hesaplanabilir bir şekilde ayrılabilir ve farklı konformasyonların yapı belirlenmesi eşi benzeri görülmemiş detay seviyesinde yapılabilir. Son zamanlarda, zorlayıcı moleküllerin yoğunluk haritaları, de novo model yapımına izin veren çözünürlüklerde üretilebilir ve bu nedenle bunların hareket tarzlarının derin bir şekilde anlaşılması 2 , 3 , 4 , 5. 3DEM (3D Elektron Mikroskopisi) topluluğunda (https://tr.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) çok çeşitli görüntü işleme yazılım paketleri mevcuttur ve bunların çoğu sürekli geliştirilmektedir. EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ve SPARX 11 gibi çeşitli yazılım paketleri ile çeşitli molekül ağırlığı ve simetrileri sergileyen proteinler için yaklaşık atom özünürlüğü elde edilmiştir. Her pakette kullanıcı uzmanlığının farklı bir seviyesi gerekiyor ve farklı düzeylerde kullanıcı kılavuzu, otomasyon ve genişletilebilirlik sağlıyor. Ayrıca, bazı programlar görüntü analizinin tüm adımlarını kolaylaştırmak için eksiksiz ortamlar sağlarken, bazıları bilinen r&#39;den başlayarak hizalama parametrelerinin arıtılması gibi belirli görevleri optimize etmek üzere tasarlanmıştır.Eferans yapısı. Daha yakın tarihte, yukarıda listelenen farklı yazılım paketlerinden gelen yaklaşımları ve protokolleri birleştiren tek bir işleme hattı sağlayan APPION 12 ve SCIPION 13 dahil olmak üzere çeşitli platformlar geliştirildi. Mevcut cryo-EM gelişimine katkıda bulunmak için SPARX, SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) adı verilen tek parçacık analizi için yeni ve bağımsız bir platform haline getirildi. Teknolojinin bu alandaki yeni araştırmacılar için erişilebilirliğini arttırmak ve modern tümüyle otomatikleştirilmiş üst düzey elektron mikroskopları tarafından üretilen büyük miktardaki verilere uyum sağlamak için, işleme hattı, kullanımı kolay bir tanıtılarak yeniden tasarlandı ve basitleştirildi Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) ve iş akışının ana adımlarını otomatikleştirmek. Ayrıca, cr&#39;den hızlı, tekrarlanabilir ve otomatik yapının belirlenmesine izin vermek için yeni algoritmalar eklenmiştir.Yo-EM görüntüleri. Ayrıca, arıtılma ve heterojenite analizi sırasında üretilen ortak eserlerden kaçınmak için tekrarlanabilirlik ile geçerlilik kazandırılmıştır. Program kapsamlı bir şekilde değiştirilmesine rağmen, takdir edilen çekirdek özellikleri korunmuştur: basit açık kaynak kod, modern nesne yönelimli tasarım ve tüm temel fonksiyonlar için Python arayüzleri. Böylece, kullanıcıların Python kodunu inceleyip kolayca değiştirebilmelerini, ek uygulamalar yaratmalarını veya genel iş akışını değiştirmelerini sağlayan bir kara kutu programı olarak değiştirilmedi. Bu, standart olmayan cryo-EM projeleri için özellikle yararlıdır. Burada, SPHIRE&#39;nin GUI&#39;sini kullanarak cryo-EM görüntülerinden atom-altı bir çözünürlük yoğunluğu haritası elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Çiğ cryo-EM direkt dedektör filmlerinden yoğunluk haritası oluşturmak için gereken tüm aşamaları ayrıntılı olarak açıklar ve herhangi bir makromolekül tipi ile sınırlı değildir. Bu protokol esas olarak newc&#39;yiIş akışıyla sahaya çıkıyor ve işlemenin önemli adımlarının yanı sıra olası tuzaklar ve engeller hakkında önemli bilgiler sağlıyor. Daha gelişmiş özellikler ve SPHIRE&#39;nin arkasındaki teorik arka plan başka yerlerde açıklanacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (Yüksek Çözünürlüklü Elektron Mikroskopisi için SPARX), tek parçacıklı elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) verilerinin yarı otomatik olarak işlenmesi için yeni ve açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir yazılım paketidir. Burada sunulan protokol, kullanıcıları tek parçacıklı yapı tayini boru hattının tüm adımları boyunca yönlendirerek, cryo-EM mikrograf filmlerinden başlayarak atom-altı bir çözünürlük yapısının nasıl elde edilebileceğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu adımlar, yeni SPHIRE grafik kullanıcı arayüzünden kontrol edilir ve minimum kullanıcı müdahalesi gerektirir. Bu protokolü kullanarak, Photorhabdus luminescens&#39;den bir Tc toksin kompleksi olan 3.5Å yapıdaki TcdA1 , yalnızca 9500 tek parçacıktan türetilmiştir. Bu aerodinamik yaklaşım, acil makromoleküler komplekslerinin doğal hallerinde gürültülü ve tarafsız atomik modeller elde etmeleri için, kapsamlı bir işleme deneyimi olmayan acemi kullanıcılara ve önceden yapılmış bir yapısal bilgiye yardımcı olacaktır.

<html> Yukarıda açıklanan protokol, Photorhabdus luminescens Tc kompleksinin (TcdA1) 20 , 21 , 22 A bileşeninin 112 direkt dedektör filminden başlayarak gerçekleştirildi . Bu veri seti, 300 kV&#39;lik bir ivme voltajında ​​çalıştırılan, parlaklık dereceli bir alan emisyon tabancasına (XFEG) sahip bir Cs-düzeltilmiş elektron kriyo-mikroskopta kaydedildi. Görüntüler, numune ölçeğinde 1,14 Å&#39;luk bir piksel boyutunda otomatik olarak toplam 60 e - / Â -2 dozuyla edinildi. Film çerçevelerinin hizalanmasından sonra ( Protokol Adım 2 ), elde edilen hareket düzeltilmiş ortalamalara yüksek çözünürlüklü izotropik Thon halkaları vardı ( Şekil 2a ). Bireysel parçacıklar kolayca görülebilir ve iyi ayrılmıştır ( Şekil 2b ). Parçacıklar daha sonra e2boxer&#39;ın toplayıcı aracı kullanılarak toplandıLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( Protokol Adım 4.1 ). Bu durumda, daha seçici seçeneği kullanarak uygun bir eşik ayarlandı ( Şekil 2c ). 112 sayısal mikrografından 9,652 parçacık elde edildi. Çıkarılan görüntülerin çoğunluğu ( Protokol Adımı 4.2 ) iyi tanımlanmış parçacıklar içeriyordu ve kutu boyutu, önerilen şekilde partikül boyutunun ~ 1.5 kat daha büyüktü ( Şekil 2d ). Daha sonra, ISAC kullanarak, 2D heterojenite analizi yapıldı ( Protokol Adım 5 ). 98 sınıf ortalamasına ulaştı ( Şekil 3a ). Bu 2D sınıf ortalamalarını kullanarak, orta çözünürlükte VIPER ( Protokol Adımı 6 ) kullanılarak bir ab initio modeli hesaplandı ( Şekil 3b ). Bu model 3.9 Å çözünürlük 22 ( Şekil 3c ) daha önce çözülmüş TcdA1 kristal yapısı ile mükemmel bir uyum göstermektedir. Bu ab initio modeli ilk tem olarak kullanılmıştır<html> Sadece 40.000 asimetrik birimden 3,5 A (0.143 kriter) yeniden yapılandırma ( Protokol Adımı 7 ) veren 3 boyutlu iyileştirme için (MERIDIEN) plakadır ( Şekil 4 ). Bu atom altı çözünürlük haritası, çoklu çekirdekten yararlanan iş akışının basamakları için 96 CPU&#39;yu kullanarak 24 saat içinde elde edildi. 3B değişkenlik analizi için (Protokol adımı 8), adım 8.3.3&#39;te ( yani başlangıçta 5 başlangıç ​​3D grupla başlar ) grup başına yalnızca 2.000 parçacık görüntüsü kullanılmış ve adım 8.3.4&#39;teki en küçük grup boyutu için 200 görüntü elde edilmiştir. Az sayıda parçacık (~ 10.000). Analiz esas olarak, saflaştırmada kullanılan His etiketini içeren kompleksin N-terminal bölgesinde lokalize esneklik ortaya koydu ( Şekil 5a ). Aslında, oniki N-terminal kalıntısı ve His etiketi, daha önce yayınlanan TcdA1 kristal yapısında çözülmedi&quot;22 ve bu muhtemelen düzensiz bölge muhtemelen esnekliği nedeniyle mevcut kriyo-EM yoğunluğunda çözülemedi ve reseptör bağlama alanlarında ve BC-bağlama alanlarında ilave değişkenlik tespit edildi ( Şekil 5a ). Yapının tatmin edici çözünürlüğü ve veri kümesinin oldukça küçük boyutu ile bu heterojenliğin tolere edilebilir olduğu kararlaştırıldı ve bu nedenle odaklanmış bir 3D sınıflandırma 23 gerçekleştirilmedi Son olarak, nihai yoğunluk haritasının yerel çözünürlüğü hesaplandı ( Protokol adımı 9.1, Şekil 5b ) ve keskinleştirilmiş 3D harita yerel olarak filtrelendi ( Protokol adımı 9.2) . Bu kalitede bir kalite, Coot 24 veya başka bir arıtma aracı kullanarak de novo model oluşturma için kullanılabilir ( Şekil 6 ). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; Şekil 1: SPHIRE kullanan görüntü işleme. ( A ) SPHIRE yazılım paketinin GUI&#39;si. İş akışının belirli bir adımı, GUI&#39;nin solundaki ilgili piktogramı seçerek etkinleştirilebilir (&quot;iş akışı basamağı&quot;). İş akışının bu adımı ile ilişkili komutlar ve yardımcı programlar GUI&#39;nin merkezi alanında görünecektir. Komutlardan birini seçtikten sonra ilgili parametreler GUI&#39;nin sağında gösterilir. Gelişmiş parametreler genellikle varsayılan varsayılan değerlerin değiştirilmesini gerektirmez. ( B ) SPHIRE GUI&#39;yi kullanarak tek parçacık görüntü işlemenin iş akışındaki aşamalar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Şekil 2: Hareket Düzeltmesi ve PartikülLe Çıkarma. ( A , b ) 1.7 μm&#39;lik bir odaksızlıkta kaydedilen, tipik, yüksek kalitede, düşük dozda, sürüklenerek düzeltilmiş dijital mikrograf. Güç tayfında (a) 2.7 A çözünürlüğüne uzanan izotropik Thon halkaları ve 2D görüntüde ( b ) görülebilen parçacıklara dikkat edin. ( C ) E2boks kullanarak tanecik seçimi. Yeşil daireler seçilen parçacıkları gösterir. ( D ) Doz ağırlıklı mikrografından çıkarılan tipik ham parçacıklar. Ölçek çubukları = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Şekil 3: 2D Kümeleme ve İlk Model Üretimi. ( A ) 2D sınıf ortalamalarının galerisi, çoğunluk, yan görüşleri temsil etmektedir o<html> Parçacık. Ölçek çubuğu = 20 nm. ( B ) Referanssız sınıf ortalamalarından RVIPER kullanılarak elde edilen TcdA1&#39;in Ab initio 3D haritası. ( C ) TcdA1 kristal yapısının (kurdele) (pdb-id 1VW1) ilk cryo-EM yoğunluğuna (şeffaf gri) rijit gövde uydurma. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Şekil 4: TcdA1&#39;in Cryo-EM 3D Yapısı. ( A , b ) ~ 9,500 parçacık görüntüleri kullanılarak hesaplanan TcdA1&#39;in son 3.5 Â yoğunluk haritası: ( a ) yan ve ( b ) üstten görünüş. ( C ) Bir α-helezon ve bir β-tabakası için kriyo-EM yoğunluğunun temsili alanları.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Şekil 5: Değişkenlik Analizi ve Yerel Çözünürlük. ( A ) Bıçaklanmış TcdA1 cryo-EM haritasının (gri) yüzeyi ve değişkenlik haritası (yeşil). Daha iyi netlik için değişkenlik haritası, 30A&#39;ya düşük geçirimli filtrelendi. ( B ) TcdA1 bilenmiş cryo-EM haritasının yerel çözünürlüğüne (Å) göre renklendirilmesi. Değişkenliği yüksek alanlar ve düşük yerel çözünürlük arasındaki topolojik anlaşmayı not edin. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Şekil 6: 3D ModCoot kullanarak TcdA1&#39;in el Yapımı. Cryo-EM yoğunluğunun temsil ettiği bölgeler ve atomik model, bir α-heliks için gösterilir. Atom modeli Coot&#39;u kullanarak yeni inşa edildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Scipion ile Kriyo-EM ve Tek Parçacık Analizi

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...