Name: cellular redox profiling using high-content microscopy
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Het onderstaande protocol wordt beschreven als uitgevoerd voor NHDF-cellen en met behulp van de multiwellplaten die in het materiaalbestand zijn gespecificeerd. Zie Figuur 1 voor een algemeen overzicht van de workflow. 1. Bereiding van reagentia <ol><li> Bereid volledig medium op door Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) te gebruiken met 10% v / v foetale boviene serum (FBS) en 100 IE / ml penicilline en 100 IE / mL streptomycine (PS). Voor 500 ml volle...

<ol>
	<li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction.">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging).">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).</li><li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria.">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling.">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li><li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency.">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li><li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders.">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li><li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II,+III,+IV+and+V.">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li><li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics.">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+deficiency:+radical+changes+in+mitochondrial+morphology?.">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation.">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+oxidative+stress+and+cell+spreading+using+5-(and-6)-chloromethyl-2+&amp;#34;,7+-&amp;#34;dichlorofluorescein.">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &amp;#34;,7 -&amp;#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li><li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy.">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li><li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A/C+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates.">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li><li>Zuiderveld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+limited+adaptive+histogram+equalization.">Contrast limited adaptive histogram equalization.</a> Graphics gems IV. , 474-485 (1994).</li><li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).</li><li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nparcomp:+An+R+Software+Package+for+Nonparametric+Multiple+Comparisons+and+Simultaneous+Confidence+Intervals.">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li><li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4(+)+T-cell+death.">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li><li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype:+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors.">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li><li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis.">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li><li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release:+protection+with+thymoquinone.">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li><li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production,+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation.">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li><li>Boci&#261;ga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes.">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li><li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nelfinavir,+an+HIV+protease+inhibitor,+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway.">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li><li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning.">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035 (2015).</li><li>. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf</a> (2006)</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li><li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy.">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li><li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells.">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li><li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging.">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li><li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension.">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li><li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells.">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li><li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy.">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li><li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity.">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li><li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays.">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li><li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry.">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li></ol>

Dit document beschrijft een microscopiemethode met hoge inhoud voor de gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus en mitochondriale morfofunctie in NHDF. Zijn prestatie werd aangetoond met een casestudy over SQV-behandelde NHDF. De resultaten ondersteunen eerder bewijs uit de literatuur waarin verhoogde ROS niveaus of mitochondriale dysfunctie zijn waargenomen na behandeling met type 1 HIV protease remmers, zij het in afzonderlijke experimenten 19 , ...

<html> De concentratie van intracellulaire ROS wordt nauwgezet gereguleerd door een dynamisch wisselwerking tussen ROS-producerende en ROS-defusing systemen. Onevenwicht tussen de twee veroorzaakt een staat van oxidatieve stress. Onder de belangrijkste bronnen van ROS zijn mitochondriën 1 . Gezien hun rol in cellulaire ademhaling, zijn ze verantwoordelijk voor het grootste deel van intracellulaire superoxide (O 2 • - ) moleculen 2 . Dit komt voornamelijk uit elektronleklek op O2 bij complex 1 van de elektron transportketting onder omstandigheden van sterk negatief innerlijk mitochondriaal membraanpotentieel (ψψ m ), dat wil zeggen mitochondriale hyperpolarisatie. Aan de andere kant is mitochondriale depolarisatie ook gecorreleerd met verhoogde ROS-productie die wijst op meerdere werkingsmethoden 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Door middel van redoxmodificaties in eiwitten van de splitsingsfusie-machines coördineren ROS de mitochondriale morfologie 9. Bijvoorbeeld, fragmentatie is gecorreleerd met verhoogde ROS-productie en apoptose 10 , 11 , terwijl filamente mitochondriën zijn gekoppeld aan voedingshongersnood en bescherming tegen Mitofagie 12 . Gezien de ingewikkelde relatie tussen cellulaire ROS en mitochondriale morfofunctie, zouden beide ideaal gelijktijdig in levende cellen gekwantificeerd moeten worden. Om dit precies te doen, werd een hoogwaardige beeldbepalingstest ontwikkeld op basis van geautomatiseerde widefieldmicroscopie en beeldanalyse van aanhechtende celculturen die gekleurd zijn met de fluorescerende probes CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (mitochondriale Δψ m en morfologie). High-content beeldvorming verwijst naar de extractie van spAtiotemporally rich ( dat wil zeggen een groot aantal beschrijvende eigenschappen) informatie over cellulaire fenotypen met behulp van meerdere complementaire markers en geautomatiseerde beeldanalyses. In combinatie met geautomatiseerde microscopie kunnen veel monsters parallel worden gescreend ( dwz hoge doorvoer), waardoor de statistische kracht van de test wordt verhoogd. Inderdaad, een belangrijk voordeel van het protocol is dat het gelijktijdige kwantificering van meerdere parameters in dezelfde cel mogelijk maakt, en dit voor een groot aantal cellen en condities. Het protocol is verdeeld in 8 delen (in detail beschreven in het protocol hieronder): 1) Zaadcellen in een 96-putjesplaat; 2) Bereiding van voorraadoplossingen, werkoplossingen en afbeeldingsbuffer; 3) Opstelling van de microscoop; 4) Laden van de cellen met CM-H2 DCFDA en TMRM; 5) Eerste live imaging ronde om basale ROS niveaus en mitochondriale morphofunction te meten; 6) Tweede live imaging ronde na toevoeging van tert -butylPeroxide (TBHP) om geïnduceerde ROS niveaus te meten; 7) Automatische beeldanalyse; 8) Gegevensanalyse, kwaliteitscontrole en visualisatie. De test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor normale humane dermale fibroblasten (NHDF). Aangezien deze cellen groot en plat zijn, zijn ze goed geschikt voor het beoordelen van mitochondriale morfologie in 2D breedbeeldbeelden 13 , 14 . Echter, met kleine wijzigingen, is deze methode van toepassing op andere aanhechtende celtypes. Bovendien, naast de combinatie van CM-H 2 DCFDA en TMRM, voldoet de workflow aan een verscheidenheid aan fluorescerende kleurstofparen met verschillende moleculaire specificaties 1 , 15 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C6827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma)Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 &#181;L-Black 0.17 mm Low Glass Lidded</td>
			<td>Brooks life science systems</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Phenol Red 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE10-527F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M 500mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA) Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-166-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti eclipse widefield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Focus System (PFS)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>hardware-based autofocus system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio Version 1.0.44</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular redox profiling using high-content microscopy

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) regelen essentiële cellulaire processen, waaronder genuitdrukking, migratie, differentiatie en proliferatie. Overmatige ROS-niveaus veroorzaken echter een toestand van oxidatieve stress, die gepaard gaat met onomkeerbare oxidatieve schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Zo geeft kwantificering van ROS een directe proxy voor cellulaire gezondheidstoestand. Aangezien mitochondriën tot de belangrijkste cellulaire bronnen en doelstellingen van ROS behoren, is gezamenlijke analyse van mitochondriale functie en ROS-productie in dezelfde cellen van cruciaal belang voor het beter begrijpen van de interconnectie in pathofysiologische omstandigheden. Daarom is een microscopie gebaseerde strategie ontwikkeld voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS niveaus, mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨ m ) en mitochondriale morfologie. Het is gebaseerd op geautomatiseerde widefield fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse van levende aanhechtende cellen, gegroeid in platen met meerdere putjes en staineD met de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen CM-H 2 DCFDA (ROS) en TMRM (ΔΨ m en mitochondriale morfologie). In tegenstelling tot fluorimetrie of flowcytometrie, kan deze strategie kwantificering van subcellulaire parameters op het niveau van de individuele cel met hoge spatiotemporale resolutie, zowel voor als na experimentele stimulatie. Belangrijk is dat de beeldgebaseerde aard van de werkwijze het mogelijk maakt om morfologische parameters te extraheren naast signaalintensiteiten. De gecombineerde funktieset wordt gebruikt voor exploratieve en statistische multivariate data-analyse om verschillen tussen subpopulaties, celtypes en / of behandelingen te detecteren. Hier wordt een gedetailleerde beschrijving van de analyse verstrekt, samen met een voorbeeld-experiment dat zijn potentieel voor ondubbelzinnige discriminatie tussen cellulaire staten bewijst na chemische verstoring.

De test is getest met behulp van verschillende controle experimenten, waarvan de resultaten worden beschreven in Sieprath et al. 1 . In het kort is de fluorescentie reactie van CM-H2 DCFDA en TMRM op extrane geïnduceerde veranderingen in respectievelijk intracellulaire ROS en Δψm , gekwantificeerd om het dynamische bereik te bepalen. Voor CM-H 2 DCFDA vertoonde NHDF een lineaire toename in fluorescentiesignaal wanneer behandeld me...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

In dit artikel wordt een microscopie-werkstroom voor hoge inhoud voor gelijktijdige kwantificering van intracellulaire ROS-niveaus aangeboden, evenals mitochondriale membraanpotentiaal en morfologie - gezamenlijk aangeduid als mitochondriale morfofunctie - in levend aanhechtende cellen met behulp van de celdoorlatende fluorescerende reportermoleculen 5- (en- 6) -chloormethyl-2 &#39;, 7&#39;-dichloordihydrofluoresceendiacetaat, acetylester (CM-H2 DCFDA) en tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling Met High-Content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Een High-inhoud Imaging Workflow om Grb2 signaalcomplexen Studie door Expression Klonen

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Door gebruik te maken van de automaten Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...