Name: cellular redox profiling using high-content microscopy
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Das nachstehende Protokoll wird für NHDF-Zellen und unter Verwendung der in der Materialdatei angegebenen Multiwell-Platten beschrieben. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über den Workflow. 1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Fetal Bovine Serum (FBS) und 100 IE / ml Penicillin und 100 IE / ml Streptomycin (PS) ergänzen. Für 5...

<ol>
	<li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction.">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging).">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).</li><li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria.">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling.">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li><li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency.">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li><li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders.">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li><li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II,+III,+IV+and+V.">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li><li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics.">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+deficiency:+radical+changes+in+mitochondrial+morphology?.">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation.">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+oxidative+stress+and+cell+spreading+using+5-(and-6)-chloromethyl-2+&amp;#34;,7+-&amp;#34;dichlorofluorescein.">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &amp;#34;,7 -&amp;#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li><li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy.">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li><li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A/C+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates.">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li><li>Zuiderveld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+limited+adaptive+histogram+equalization.">Contrast limited adaptive histogram equalization.</a> Graphics gems IV. , 474-485 (1994).</li><li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).</li><li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nparcomp:+An+R+Software+Package+for+Nonparametric+Multiple+Comparisons+and+Simultaneous+Confidence+Intervals.">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li><li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4(+)+T-cell+death.">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li><li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype:+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors.">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li><li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis.">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li><li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release:+protection+with+thymoquinone.">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li><li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production,+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation.">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li><li>Boci&#261;ga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes.">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li><li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nelfinavir,+an+HIV+protease+inhibitor,+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway.">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li><li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning.">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035 (2015).</li><li>. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf</a> (2006)</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li><li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy.">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li><li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells.">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li><li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging.">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li><li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension.">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li><li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells.">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li><li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy.">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li><li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity.">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li><li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays.">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li><li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry.">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li></ol>

Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten 19...

<html> Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O 2 • - ) - Moleküle 2 . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O 2 am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mitochondrialen Membranpotentials (Δψ m ), dh mitochondrialer Hyperpolarisation. Auf der anderen Seite wurde auch die mitochondriale Depolarisation mit einer erhöhten ROS-Produktion korreliert, die auf mehrere Wirkmechanismen 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 Darüber hinaus wird durch Redox-Modifikationen in Proteinen der Spalt-Fusions-Maschinerie ROS die mitochondriale Morphologie 9 regulieren. Beispielsweise ist die Fragmentierung mit einer erhöhten ROS-Produktion und Apoptose 10 , 11 korreliert, während filamentöse Mitochondrien mit Nährstoffverhungern und Schutz verbunden sind Mitophagie 12 Angesichts der komplizierten Beziehung zwischen zellulärem ROS und mitochondrialer Morphofunktion sollten beide idealerweise gleichzeitig in lebenden Zellen quantifiziert werden. Um dies genau zu tun, wurde ein hochauflösender Bildgebungsassay auf der Grundlage einer automatisierten Breitfeldmikroskopie und einer Bildanalyse von adhärenten Zellkulturen entwickelt, die mit den Fluoreszenzsonden CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (mitochondrialem Δψ m und Morphologie) gefärbt wurden. High-Content-Imaging bezieht sich auf die Extraktion von spAtiotemporell reiche ( dh große Anzahl von beschreibenden Merkmalen) Informationen über zelluläre Phänotypen mit mehreren komplementären Markern und automatisierten Bildanalysen. In Kombination mit automatisierter Mikroskopie können viele Proben parallel ( dh Hochdurchsatz) abgeschirmt werden, wodurch die statistische Kraft des Assays erhöht wird. In der Tat ist ein Hauptbestandteil des Protokolls, dass es die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Parametern in der gleichen Zelle ermöglicht, und dies für eine große Anzahl von Zellen und Bedingungen. Das Protokoll wird in 8 Teile aufgeteilt (im Detail beschrieben im Protokoll): 1) Seeding-Zellen in einer 96-Well-Platte; 2) Vorbereitung von Stammlösungen, Arbeitslösungen und Bildgebungspuffer; 3) Aufstellung des Mikroskops; 4) Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM; 5) Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der basalen ROS-Werte und der mitochondrialen Morphofunktion; 6) Zweite Live-Bildgebung nach Zugabe von tert. -ButylPeroxid (TBHP) zur Messung induzierter ROS-Werte; 7) Automatisierte Bildanalyse; 8) Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Visualisierung. Der Assay wurde ursprünglich für normale menschliche dermale Fibroblasten (NHDF) entwickelt. Da diese Zellen groß und flach sind, eignen sie sich gut zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in 2D-Weitfeldbildern 13 , 14 . Bei kleineren Modifikationen ist diese Methode jedoch auf andere adhärente Zelltypen anwendbar. Darüber hinaus entspricht neben der Kombination von CM-H 2 DCFDA und TMRM der Workflow einer Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffpaaren mit unterschiedlichen molekularen Spezifitäten 1 , 15 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C6827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma)Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 &#181;L-Black 0.17 mm Low Glass Lidded</td>
			<td>Brooks life science systems</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Phenol Red 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE10-527F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M 500mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA) Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-166-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti eclipse widefield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Focus System (PFS)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>hardware-based autofocus system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio Version 1.0.44</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular redox profiling using high-content microscopy

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.

Der Assay wurde mit mehreren Kontrollversuchen benchmarkiert, deren Ergebnisse in Sieprath et al. 1 In kurzer Zeit wurde die Fluoreszenzantwort von CM-H 2 DCFDA und TMRM auf fremd induzierte Veränderungen in intrazellulärem ROS und Δψ m quantifiziert, um den dynamischen Bereich zu bestimmen. Für CM-H 2 DCFDA zeigte NHDF eine lineare Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei der Behandlung mit steigenden Konzentrationen von...

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Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 &#39;, 7&#39;-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Cellular Redox Profiling mit hochauflösender Mikroskopie

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

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Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

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Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

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In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

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Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

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High Content Screening-Analyse die toxikologischen Wirkungen von gefährlichen und potenziell gefährlichen Inhaltsstoffe (HPHC) zur Bewertung

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

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