Name: cellular redox profiling using high-content microscopy
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת אנטוורפן (TTBOF / 29267, TTBOF / 30112), קרן המחקר המיוחד של אוניברסיטת גנט (פרויקט BOF / 11267/09), NB-Photonics (קוד פרוייקט 01-MR0110) ו- CSBR עבור ביולוגיה של מערכות מחקר) יוזמה של הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO: לא: CSBR09 / 013V). חלקים מכתבי יד אלה הותאמו מפרסום אחר, באישורו של שפרינגר. המחברים מודים לחירט מייסן על עזרתו במיקרוסקופ.

פרוטוקול להלן מתואר כפי שבוצעה עבור תאים NHDF ועם השימוש של לוחות multiwell המפורטים בקובץ חומרים. ראה איור 1 לקבלת סקירה כללית על זרימת העבודה. 1. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בי?...

<ol>
	<li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction.">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging).">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).</li><li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria.">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling.">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li><li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency.">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li><li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders.">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li><li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II,+III,+IV+and+V.">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li><li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics.">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+deficiency:+radical+changes+in+mitochondrial+morphology?.">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation.">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+oxidative+stress+and+cell+spreading+using+5-(and-6)-chloromethyl-2+&amp;#34;,7+-&amp;#34;dichlorofluorescein.">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &amp;#34;,7 -&amp;#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li><li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy.">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li><li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A/C+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates.">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li><li>Zuiderveld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+limited+adaptive+histogram+equalization.">Contrast limited adaptive histogram equalization.</a> Graphics gems IV. , 474-485 (1994).</li><li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).</li><li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nparcomp:+An+R+Software+Package+for+Nonparametric+Multiple+Comparisons+and+Simultaneous+Confidence+Intervals.">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li><li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4(+)+T-cell+death.">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li><li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype:+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors.">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li><li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis.">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li><li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release:+protection+with+thymoquinone.">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li><li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production,+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation.">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li><li>Boci&#261;ga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes.">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li><li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nelfinavir,+an+HIV+protease+inhibitor,+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway.">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li><li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning.">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035 (2015).</li><li>. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf</a> (2006)</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li><li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy.">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li><li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells.">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li><li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging.">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li><li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension.">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li><li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells.">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li><li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy.">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li><li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity.">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li><li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays.">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li><li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry.">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li></ol>

מאמר זה מתאר שיטה גבוהה תוכן מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים ו morphofunction המיטוכונדרי ב NHDF. הביצועים שלה הודגם עם מקרה מבחן על SQV שטופלו NHDF. התוצאות תומכות בראיות מוקדמות יותר מהספרות שבהן רמות ROS גבוהות או תפקוד מיטוכונדריאלי נצפו לאחר טיפול במעכבי פרוטאז מסו?...

<html> ריכוז של ROS תאיים הוא מוסדר בקפידה באמצעות אינטראקציה דינמית בין ROS לייצר ROS מערכות defusing. חוסר איזון בין שני מעורר מצב של מתח חמצוני. בין המקורות העיקריים של ROS הם המיטוכונדריה 1 . בהינתן תפקידם בנשימה התאית, הם אחראים על חלק הארי של מולקולות הסופר-חמצן הבין-תאיות (O 2 - - ). זה נובע בעיקר דליפת אלקטרונים O 2 ב 1 מורכבים של שרשרת התחבורה האלקטרון בתנאים של פוטנציאל פנימי שלילי מיטוכונדריאלי שלילי (Δψ מ &#39; ), כלומר hyperpolarization המיטוכונדריה. מצד שני, dololarization המיטוכונדריה יש גם מתואמים עם ייצור ROS מוגברת הצבעה על מצבים מרובים של פעולה 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . יתר על כן, באמצעות שינויים חזיון חלבונים של מנגנון היתוך ביקוע, ROS שיתוף להסדיר מורפולוגיה המיטוכונדריה 9. לדוגמה, פיצול הוא בקורלציה עם ייצור ROS גדל אפופטוזיס 10 , 11 , בעוד המיטוכונדריה נימי נקשרו הרעב התזונתי והגנה מפני מיטופגי 12 . לאור היחסים המורכבים בין ROS הסלולר morphofunction המיטוכונדרי, שניהם באופן אידיאלי צריך לכמת בו זמנית בתאים חיים. כדי לעשות בדיוק את זה, assay הדמיה תוכן גבוהה פותחה על בסיס מיקרוסקופ widefield אוטומטיות וניתוח תמונה של תרבויות תא חסיד מוכתם בדיקות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (מיטוכונדריאלי Δψ מ ומורפולוגיה). הדמיה בתוכן גבוה מתייחסת להפקת spAtiotemporally עשיר ( כלומר , מספר גדול של תכונות תיאוריות) מידע על פנוטיפים הסלולר באמצעות מספר סמנים משלימים וניתוחי תמונה אוטומטיים. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית דגימות רבות ניתן לוקרן במקביל ( כלומר , תפוקה גבוהה), ובכך להגדיל את הכוח הסטטיסטי של assay. ואכן, הנכס העיקרי של הפרוטוקול הוא שהוא מאפשר כימות בו זמנית של פרמטרים מרובים בתא זהה, וזאת עבור מספר רב של תאים ותנאים. פרוטוקול מחולק 8 חלקים (המתואר בפירוט בפרוטוקול להלן): 1) תאים זורעים בצלחת 96-היטב; 2) הכנת פתרונות מלאי, פתרונות עבודה ומאגר הדמיה; 3) הגדרת המיקרוסקופ; 4) טוען של תאים עם CM-H 2 DCFDA ו TMRM; 5) הראשון הדמיה חיה כדי למדוד את רמות הבסיס ROS ו morphofunction המיטוכונדריה; 6) סיבוב הדמיה חיה שנייה לאחר תוספת של tert -butyl(TBHP) כדי למדוד רמות ROS המושרה; 7) ניתוח תמונה אוטומטי; 8) ניתוח נתונים, בקרת איכות ויזואליזציה. Assay פותחה במקור עבור fibroblasts נורמלי אנושי (NHDF). מאז תאים אלה גדולים ושטוחים, הם מתאימים גם להערכת מורפולוגיה המיטוכונדריאלי בתמונות widefield 2D 13 , 14 . עם זאת, עם שינויים קלים, שיטה זו חלה על סוגי תאים אחרים חסיד. יתר על כן, ליד השילוב של CM-H 2 DCFDA ו TMRM, זרימת העבודה תואם מגוון רחב של זוגות צבע פלורסנט עם תכונות מולקולריות שונות 1 , 15 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C6827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma)Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 &#181;L-Black 0.17 mm Low Glass Lidded</td>
			<td>Brooks life science systems</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Phenol Red 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE10-527F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M 500mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA) Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-166-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti eclipse widefield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Focus System (PFS)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>hardware-based autofocus system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio Version 1.0.44</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cellular redox profiling using high-content microscopy

מינים חמצן תגובתי (ROS) מווסתים תהליכים תאיים חיוניים, כולל ביטוי גנטי, הגירה, הבחנה והתפשטות. עם זאת, רמות ROS מוגזמות לגרום למצב של מתח חמצוני, אשר מלווה בנזק חמצוני בלתי הפיך ל- DNA, שומנים וחלבונים. לפיכך, כימות של ROS מספק פרוקסי ישיר למצב הבריאות הסלולרית. מאז המיטוכונדריה הם בין המקורות הסלולר העיקריים ומטרות של ROS, ניתוח משותף של תפקוד המיטוכונדריה ו ROS הייצור באותם תאים הוא חיוני להבנה טובה יותר של הקישוריות בתנאים פתופיזיולוגיים. לכן, אסטרטגיה גבוהה מבוסס מיקרוסקופ אסטרטגיה שפותחה עבור כימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (ΔΨ מ &#39; ) ומורפולוגיה המיטוכונדריה. הוא מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומאטי widefield וניתוח תמונה של תאים חסיד חיים, גדל צלחות רב, וכן staineD עם חדיר תאים חדיר מולקולות פלורסנט CM-H 2 DCFDA (ROS) ו TMRM (ΔΨ מ ו מורפולוגיה המיטוכונדריה). בניגוד fluorimetry או זרימת cytometry, אסטרטגיה זו מאפשרת כימות הפרמטרים subcellular ברמה של תא בודד עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal, הן לפני ואחרי גירוי ניסיוני. חשוב לציין, את האופי מבוסס התמונה של השיטה מאפשרת לחלץ פרמטרים מורפולוגיים בנוסף עוצמת האות. מערך התכונות המשולב משמש לניתוח נתונים רב-משתני וניתוח סטטיסטי כדי לזהות הבדלים בין תת-אוכלוסיות, סוגי תאים ו / או טיפולים. הנה, תיאור מפורט של assay מסופק, יחד עם ניסוי לדוגמה זה מוכיח את הפוטנציאל שלה לאפליה חד משמעית בין מדינות הסלולר לאחר הפרעה כימית.

Assay כבר benchmarked באמצעות מספר ניסויים שליטה, את התוצאות אשר מתוארים Sieprath et al. 1 . בקצרה, התגובה הקרינה של CM-H 2 DCFDA ו TMRM לשינויים המושרה באופן חיצוני ROS תאיים Δψ מ &#39;, בהתאמה כבר לכמת כדי לקבוע את טווח דינמי. עבור CM-H 2 DCFDA, הר...

Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 &#39;, 7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Profiling glycan של פולימרי דופן תא צמח באמצעות מערכים

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

ניתוח תוכן גבוה קוד פתוח ניצול מיקרוסקופי הדמית חי קרינה האוטומטית

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...