Name: cellular redox profiling using high-content microscopy
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

아래의 프로토콜은 NHDF 세포와 재료 파일에 명시된 멀티 웰 플레이트를 사용하여 수행되는 것으로 설명됩니다. 워크 플로의 일반적인 개요는 그림 1 을 참조하십시오. 1. 시약의 준비 <ol><li> 10 % v / v 태아 소 혈청 (FBS)과 100 IU / ML 페니실린과 100 IU / ML 스트렙토 마이신 (PS)와 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM) 보충하여 완벽한 매체를 준비합니다. 500 mL의 ?...

<ol>
	<li>Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+High-Content+Quantification+of+Intracellular+ROS+Levels+and+Mitochondrial+Morphofunction.">Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction.</a> AAEC. 219, 149-177 (2016).</li><li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-ros+crosstalk+in+the+control+of+cell+death+and+aging).">Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging).</a> J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).</li><li>Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+protonic+potential+actuates+a+mechanism+of+production+of+reactive+oxygen+species+in+mitochondria.">High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.</a> FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).</li><li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+matrix+reactive+oxygen+species+production+is+very+sensitive+to+mild+uncoupling.">Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling.</a> Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).</li><li>Verkaart, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+production+is+inversely+related+to+complex+I+activity+in+inherited+complex+I+deficiency.">Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).</li><li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species.">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).</li><li>Lebiedzinska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress-dependent+p66Shc+phosphorylation+in+skin+fibroblasts+of+children+with+mitochondrial+disorders.">Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders.</a> BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).</li><li>Forkink, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+hyperpolarization+during+chronic+complex+I+inhibition+is+sustained+by+low+activity+of+complex+II,+III,+IV+and+V.">Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V.</a> BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).</li><li>Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Homeostasis+and+Mitochondrial+Dynamics.">Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics.</a> Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NADH:ubiquinone+oxidoreductase+deficiency:+radical+changes+in+mitochondrial+morphology?.">Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).</li><li>Archer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics--mitochondrial+fission+and+fusion+in+human+diseases.">Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases.</a> N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).</li><li>Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+network+formation+protects+mitochondria+from+autophagosomal+degradation+during+nutrient+starvation.">Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).</li><li>Koopman, W. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+oxidative+stress+and+cell+spreading+using+5-(and-6)-chloromethyl-2+&amp;#34;,7+-&amp;#34;dichlorofluorescein.">Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 &amp;#34;,7 -&amp;#34;dichlorofluorescein.</a> Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).</li><li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy.">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li><li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A/C+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates.">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li><li>Zuiderveld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+limited+adaptive+histogram+equalization.">Contrast limited adaptive histogram equalization.</a> Graphics gems IV. , 474-485 (1994).</li><li>Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).</li><li>Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nparcomp:+An+R+Software+Package+for+Nonparametric+Multiple+Comparisons+and+Simultaneous+Confidence+Intervals.">nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals.</a> J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).</li><li>Estaquier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antiretroviral+drugs+on+human+immunodeficiency+virus+type+1-induced+CD4(+)+T-cell+death.">Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death.</a> J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).</li><li>Matarrese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+hyperpolarization+hijacks+activated+T+lymphocytes+toward+the+apoptotic-prone+phenotype:+homeostatic+mechanisms+of+HIV+protease+inhibitors.">Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors.</a> J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).</li><li>Roumier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitors+and+cytomegalovirus+vMIA+induce+mitochondrial+fragmentation+without+triggering+apoptosis.">HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis.</a> Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).</li><li>Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+protease+inhibitor+induced+oxidative+stress+suppresses+glucose+stimulated+insulin+release:+protection+with+thymoquinone.">HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone.</a> Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).</li><li>Touzet, O., Philips, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resveratrol+protects+against+protease+inhibitor-induced+reactive+oxygen+species+production,+reticulum+stress+and+lipid+raft+perturbation.">Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation.</a> AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).</li><li>Boci&#261;ga-Jasik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+effects+of+the+HIV+protease+inhibitor--saquinavir+in+differentiating+human+preadipocytes.">Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes.</a> Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).</li><li>Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nelfinavir,+an+HIV+protease+inhibitor,+induces+apoptosis+and+cell+cycle+arrest+in+human+cervical+cancer+cells+via+the+ROS-dependent+mitochondrial+pathway.">Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway.</a> Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).</li><li>Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+small+molecule+phenotypic+effects+using+mitochondrial+morpho-functional+fingerprinting+and+machine+learning.">Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning.</a> Sci. Rep. 5, 8035 (2015).</li><li>. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: <a target="_blank" href="https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf">https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf</a> (2006)</li><li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin.">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li><li>Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Convenient+Technique+to+Fix+Suspension+Cells+on+a+Coverslip+for+Microscopy.">A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy.</a> Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).</li><li>Deutsch, M., Deutsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+miniature+cell+retainer+for+correlative+high-content+analysis+of+individual+untethered+non-adherent+cells.">A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells.</a> Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).</li><li>Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+new+method+for+immobilising+kinetoplastid+parasites+for+live+cell+imaging.">Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging.</a> Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).</li><li>Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+changes+in+plasma+membrane+potential+via+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+at+individual+cell+resolution+in+suspension.">Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension.</a> JBO. 18 (12), (2013).</li><li>Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+cellular+oxygen+and+analysis+of+metabolic+responses+of+mammalian+cells.">Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells.</a> Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).</li><li>Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+live+fluorescence+imaging+of+cellular+dynamics+using+Bessel+beam+plane+illumination+microscopy.">3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy.</a> Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).</li><li>Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+plate+reader-based+methods+with+fluorescence+microscopy+for+measurements+of+intracellular+calcium+levels+for+the+assessment+of+in+vitro+neurotoxicity.">Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).</li><li>Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+standard+microtiter+plate+reading+versus+imaging+in+cellular+assays.">A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays.</a> Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).</li><li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry.">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li></ol>

이 논문은 NHDF에서 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 검사법을 설명합니다. 그 성능은 SQV가 처리 된 NHDF에 대한 사례 연구를 통해 입증되었습니다. 그 결과는 별도의 실험 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 <su...

<html> 세포 내 ROS의 농도는 ROS 생성 시스템과 ROS를 제거하는 시스템 사이의 동적 상호 작용을 통해 세 심하게 조절됩니다. 이 둘의 불균형은 산화 스트레스 상태를 일으킨다. ROS의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아이다. 세포 호흡에서의 역할을 감안할 때, 그들은 세포 내 superoxide (O 2 • - ) 분자의 대부분을 담당합니다 2 . 이것은 주로 강한 마이너스 내부 미토콘드리아 막 잠재력 (Δψ m ), 즉 미토콘드리아 과분극 조건 하에서 전자 전달 사슬의 복합체 1에서 O 2 로의 전자 누출에 기인한다. 반면에 mitochondrial depolarization은 ROS 생성 증가와 상호 작용하여 여러 형태의 작용 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . 또한 핵분열 - 핵융합 기계 단백질의 산화 환원 변형을 통해 ROS는 미토콘드리아 형태를 공동 조절한다. 예를 들어, 단편화는 ROS 생성 및 세포 사멸 증가와 관련이있다 10 , 11 , 섬유 성 미토콘드리아는 영양 기아와 보호 mitophagy 12 . 세포 ROS와 미토콘드리아 morphofunction 사이의 복잡한 관계를 감안할 때, 둘 다 살아있는 세포에서 동시에 정량화되어야합니다. 정확하게 이것을 수행하기 위해, 형광 프로브 CM-H 2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (미토콘드리아 Δψm 및 형태학)으로 염색 된 부착 세포 배양 물의 자동화 된 와이드 필드 현미경 및 이미지 분석에 기초하여 고 - 컨텐츠 이미징 분석법을 개발 하였다. 고 - 컨텐츠 이미징은 sp다중 보완 마커 및 자동화 된 이미지 분석을 사용하여 세포 phenotypes에 대해 atiotemporally 풍부한 ( 즉 , 많은 설명 기능) 정보. 자동화 된 현미경 검사와 결합하면 많은 샘플을 병렬로 ( 즉 높은 처리량) 스크리닝 할 수 있으므로 분석의 통계 능력이 향상됩니다. 사실, 프로토콜의 주요 자산은 같은 세포에서 여러 매개 변수의 동시 부량을 허용하고, 이것은 많은 세포 및 조건에서 가능하다는 것입니다. 프로토콜은 8 부분으로 나누어 져 있습니다 (아래의 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다) : 1) 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드; 2) 원액, 작업 용액 및 영상 버퍼의 준비; 3) 현미경 셋업; 4) CM-H 2 DCFDA 및 TMRM으로 세포를 로딩하는 단계; 5) 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction을 측정하는 최초의 라이브 영상 라운드; 6) tert- 부틸의 첨가 후 둥근 두번째 이미지 생성유도 된 ROS 수준을 측정하기위한 과산화수소 (TBHP); 7) 자동화 된 이미지 분석; 8) 데이터 분석, 품질 관리 및 시각화. 이 분석법은 원래 정상적인 사람 피부 섬유 아세포 (NHDF)를 위해 개발되었습니다. 이러한 세포는 크고 평평하기 때문에 2D 와이드 이미지 13 , 14 에서 미토콘드리아 형태학을 평가하는 데 적합합니다. 그러나 사소한 수정으로이 방법은 다른 접착 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 또한, CM-H 2 DCFDA와 TMRM의 조합 옆에 워크 플로우는 다른 분자 특이성 1 , 15 의 다양한 형광 염료 쌍을 준수합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C6827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma)Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 &#181;L-Black 0.17 mm Low Glass Lidded</td>
			<td>Brooks life science systems</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w/o Phenol Red 500 ml</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE10-527F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose with L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M 500mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA) Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-161E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-166-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab&#39;)&#8322; Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>Antibody used for acquiring flat-field image</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti eclipse widefield microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect Focus System (PFS)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>hardware-based autofocus system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Plan Apo Lambda 20x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio Version 1.0.44</td>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.3.2</td>
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cellular redox profiling using high-content microscopy

활성 산소 종 (ROS)은 유전자 발현, 이동, 분화 및 증식을 포함한 필수 세포 과정을 조절합니다. 그러나 과도한 ROS 수준은 DNA, 지질 및 단백질에 대한 비가 역적 산화 손상을 수반하는 산화 스트레스 상태를 유도합니다. 따라서, ROS의 정량화는 세포 건강 상태에 대한 직접적인 프록시를 제공한다. 미토콘드리아가 ROS의 중요한 세포 원 및 표적이기 때문에 같은 세포에서 미토콘드리아 기능과 ROS 생산의 공동 분석은 병리 생리 학적 조건에서 상호 연결을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 따라서, 세포 내 ROS 수준, 미토콘드리아 막 잠재력 (ΔΨ m ) 및 미토콘드리아 형태학의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 기반 전략이 개발되었습니다. 그것은 다중 웰 플레이트에서 성장한 살아있는 부착 세포의 자동화 된 광역 형광 현미경 및 이미지 분석에 기반을두고 있습니다.세포 - 투과성 형광 리포터 분자 CM-H2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (ΔΨm 및 미토콘드리아 형태학)을 사용하여 d를 측정 하였다. 형광 측정 또는 유동 세포 계측법과는 달리,이 전략은 실험 자극 전후 모두 높은 시공간 해상도를 갖는 개별 세포 수준에서 세포 매개 변수를 정량화 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법의 이미지 기반 성질은 신호 강도 이외에 형태 론적 파라미터를 추출 할 수있게한다. 결합 된 기능 세트는 하위 집단, 세포 유형 및 / 또는 치료법 간의 차이를 탐지하기위한 탐색 및 통계 다변량 데이터 분석에 사용됩니다. 여기에, 화학 섭동 후 세포 상태 사이의 모호하지 않은 차별을위한 잠재력을 증명하는 실험 예와 함께 분석에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.

분석은 여러 대조 실험을 사용하여 벤치마킹되었으며, 그 결과는 Sieprath et al. 1 . 간단히 말하면, CM-H 2 DCFDA 및 TMRM의 세포 내 ROS 및 Δψ m의 외적으로 유도 된 변화에 대한 형광 응답을 각각 동적 범위를 결정하기 위해 정량화 하였다. CM-H 2 DCFDA의 경우, NHDF는 10 μM에서 160 μM 범위의 TBHP 농도로 처리했을 때 형광 신호의 선형 ?...

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Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 &#39;, 7&#39;- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H 2 DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

TIRF 현미경과 망막 바이폴라 세포 이미징 Exocytosis

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분의 독성 효과를 평가하기 위해 높은 콘텐츠 심사 분석 (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...