Name: quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy
Uploaded: 2017-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Gunzer 연구소의 연구는 독일 연방 교육 연구부 (부여 0315590 AD)와 독일 연구 재단 (보조금 GU769 / 4-1, GU769 / 4-2)에 의해 지원되었습니다. 우리는 기술 지원에 대한 IMCES와 3D 만화 모델링에 대한 Sebastian Kubat에 감사드립니다.

모든 동물 실험은 EU 지침에 따라 수행되었으며 Essen의 관련 지방 당국 (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Germany)의 승인을 받았습니다. 동물은 SPF (specific pathogen-free) 조건하에 사용 및 보관되었습니다. 1. 디프테리아 톡신 (DTX)에 의한 심근염 유도 <ol><li> DTX 솔루션을 인산 완충 식염수 (PBS)로 1 μg / mL 작동 솔루션으로 희석하여 심근?...

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	<li>Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sichtbarmachung+und+Gr&#246;&#223;enbestimmung+ultramikoskopischer+Teilchen,+mit+besonderer+Anwendung+auf+Goldrubingl&#228;ser.">Sichtbarmachung und Gr&#246;&#223;enbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingl&#228;ser.</a> Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).</li><li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning:+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens.">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li><li>Epp, J. 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현대 생명 과학에서 생물학적 과정의 현미경 시각화는 점차 중요한 역할을합니다. 이러한 맥락에서 지난 2 세기 동안 많은 발전이 이루어져이 시점까지는 해결할 수없는 질문에 답할 수있었습니다. 첫째, 광학 현미경의 해상도 능력을 근본적으로 높이는 명백한 경향이있었습니다. 한때 가정 된 해상도 제한으로 인해 구조화 된 조명 현미경 (SIM) 21 , 22 ,...

광학 현미경의 진화 과정에서 특정 표본에 대한 시각화 과정의 한계를 최소화하기 위해 개발 된 많은 특수 형태가 나타났습니다. 그러한 방법 중 하나는 Light Sheet 형광 현미경 검사 (LSFM)입니다. 1903 년 Siedentopf와 Zsigmondy 1 에 의해 처음 개발되었으며 1990 년대 초반에 최초의 생물학적 응용을 발견했습니다 2. LSFM은 형광 신호 분해능을 가진 손상되지 않은 마우스 기관과 같은 큰 표본의 시각화를위한 가장 강력한 현미경 도구가되었습니다 세포 수준까지 이러한 이점 때문에 생존 세포 이미징 가능성과 함께 Nature Methods는 LSFM을 &quot;2014 년의 방법&quot;이라고 명명했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 LSFM의 샘플 조명은 가벼운 시트에 의해 수행됩니다.이 시트는 사용 된 대상 축에 수직으로 향하게됩니다. f또는 방출 - 광 수집 및 후속 화상 형성을 포함한다. 광 시트는 대개 원통형 렌즈로 광폭의 시준 된 레이저 빔을 초점을 맞추거나 단 하나의 수평 또는 수직 평면 4 , 5 에서 좁고 집중된 레이저 빔의 신속한 옆쪽 이동에 의해 생성됩니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 1 ~ 4㎛의 두께로 이미징 광학 기기의 초점 평면 만 조명됩니다. 결과적으로, 조명면에 배치 된 형광 표본의 경우, 산란광의 생성과 초점면 위 또는 아래 영역에서의 광 표백 효과가 모두 제거되거나 크게 억제됩니다. 초점이 맞지 않은 비행기는 모두 비추 지 않기 때문에이 지역에서는 표백 효과가 생략됩니다. 표준 공 촛점 또는 다중 광자 현미경과 달리 조명과 방출 된 빛의 경로는 서로 분리되어 있으므로 최종 이미지 품질<html> 목표물을 통한 여기 광선의 완벽한 집속에 의존하지 않습니다. 근원적 ​​인 질문에 따라, 조명 된 평면의 가장 큰 가능한 영역이 xy 방향으로 움직이는 구성 요소없이 이미지화 될 수 있도록 방대한 FOV (Field of View)와 함께 대상을 사용할 수 있습니다. 최신 LSFM 시스템에서 생성 된 광학 섹션의 형광 이미지는 매우 민감한 전하 결합 소자 (CCD) 또는 CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) 카메라에 캡처되어 FOV (전체 시야) 마이크로 초. 따라서 라이트 시트를 통해 샘플을 이동시키고 정의 된 z 단계에서 이미지를 획득함으로써 합리적인 시간 8 , 9 시간 내에 표본의 전체 3D 정보를 얻을 수 있으므로이 기술을 라이브 셀에 적용 할 수 있습니다 연구 10 ,ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . 그럼에도 불구하고, LSFM이 신속하고, 민감하며, 형광 친화적 인 방법 임에도 불구하고, 표본을 통한 빛 투과는 여전히 중요한 문제이며, 특히 큰 생물학적 샘플이 3D 분석의 타겟 일 때 특히 중요합니다. 빛의 전달은 흡수의 물리적 측면과 굴절률이 다른 구조물의 경계면에서의 광산란으로 결정적으로 변형됩니다 13 . 따라서 샘플을 수 밀리미터 크기로 이미징 할 때 LSFM은 대부분 샘플을 광학적으로 투명하게 만들기 위해 클리어링 프로토콜과 결합됩니다. 이러한 기술은 각각의 생물학적 조직에서 물을 제거하고이를 특정 표적 조직 구성 요소의 굴절률과 협소하게 매치되도록 선택되는 물 또는 유기 용매 기반 침지 매개체와 교환한다는 아이디어를 기반으로합니다. 결과적으로, 측면 광 산란이 최소화되고, 모든 파장의 광은 조직 (13) 을 훨씬 더 효율적으로 통과 할 수있다. 많은 경우, 이와 같이 처리 된 생물학적 표본은 거시적으로 맑아 보입니다. 따라서 긴 작업 거리, 저배율 목표를 사용하여 전체 마우스 기관에서도 LSFM을 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 심근염의 쥐 모델에서 세포 침투를 조사하기 위해 설립 한 가벼운 시트 현미경 (재료 표 참조)에서 대형 표본 이미징을위한 준비 프로토콜을 제시합니다 15 . CD11c.DTR 마우스는 CD11c 프로모터 16 의 제어하에 영장류 디프테리아 독소 수용체 (DTR)를 발현합니다. 따라서 DTR과 함께 CD11c를 발현하는이 마우스의 세포는 Corynebacterium diphtheria (디프테리아 독소, DTX)의 외독소에 민감하게 반응 합니다. DTX로 이들 동물을 전신 처리하면 모든 CD11c + ce가 고갈됩니다안돼. CD11c는 integrin이며 다양한 다양한 가용성 요소에 대한 세포 표면 수용체로서 주로 단핵구 계통의 세포에서 활성화 및 성숙 과정에 관여합니다 17 . 결과적으로, CD11c.DTR 마우스 모델은 다양한 면역 학적 질문의 맥락에서 수지상 세포 및 대 식세포 서브 세트의 역할을 연구하는데 집중적으로 사용되었습니다. 시간이 지남에 따라 DTX로 전신적으로 치료 된 CD11c.DTR 마우스는 부작용을 일으킬 수 있고 사망률이 급격히 상승 할 수 있다고보고되었습니다 18 , 19 . 최근 우리는 이러한 동물에서 기관 내 DTX 적용 후 극심한 심근염의 발생을 설명하는 근본적인 사망 원인을 규명 할 수 있었다. 독소에 대한 도전은 심장의 자극 전달 시스템의 중앙 부분을 포함하여 세포 파괴를 일으켰습니다. 이것은 거대한 CD45가 동반되었다.+ 백혈구 침윤, 결국 치명적인 심장 부정맥으로 이어진다. 이 경우 백혈구 개체군의 출현이 중요 할뿐 아니라 심장 내부의 공간 분포도 중요했습니다. 이 실험적인 질문은 intravital 항체 염색법과 유기 용제 기반의 광학 제거 프로토콜에 의해 뒷받침되는 light sheet microscopy 접근법으로 해결 한 현대 현미경 영상에 대한 도전 과제입니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>diphtheria toxin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine [50 mg/ml]</td>
			<td>Inresa</td>
			<td>PZN 4089014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine [2 %]</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>REF 9161502</td>
			<td>Braun Omincan F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indwelt venous catheter&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>REF 381923</td>
			<td>BD Insyte Autoguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal respirator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0044</td>
			<td>MiniVent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit-CD45 antibody (AF647)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter (21 G)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>REF 387455</td>
			<td>BD valu-set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tube (5 ml)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKY9.1</td>
			<td>Rotilabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose (low gelling)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mold (15x15x5 mm)</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Cryomold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light sheet microscope system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Ultramicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>MVX10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>0.5&#160;NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&#160;mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera 5.5MP</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm OPSL (50mW) laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 nm&#160; diode laser (50mW)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D image processing &#38; analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>IMARIS Ver. 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic mouse strain</td>
			<td>Steffen Jung et al.</td>
			<td></td>
			<td>CD11c.DTR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wt mouse strain</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td>Balb/c Ola Hsd J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Module</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2XC Objective Lens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy

빛샘 형광 현미경 (LSFM)은 화학적 제거 프로토콜과 결합하여 대형 생물 표본에서 형광 표식 구조를 분석하기위한 금본위 제가되었으며 세포 분해능에 이릅니다. 한편 기본 프로토콜의 지속적인 정제와 전문화 된 상용 시스템의 가용성 향상을 통해 우리는 전체 마우스 기관의 미세 구조를 조사 할 수 있었고 다양한 라이브 셀 이미징 접근법에서의 세포 행동의 특성을 고려할 수도있었습니다. 여기, 우리는 염증 마우스 마음에서 CD45 + 백혈구 인구의 공간 전체 마운트 시각화 및 부량에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 치명적인 심장 부정맥을 특징으로하는 치명적인 치명적인 심근염 발달 연구를 위해 강하고 유도 가능한 모델로 작용하는 것으로 최근에 알려진 트랜스 제닉 마우스 균주 (CD11c.DTR)를 사용합니다. 이 프로토콜은 심근염 유도, intravit알 항체 매개 염색, 기관 준비 및 후속 컴퓨터 보조 영상 후 처리를 포함한 LSFM을 포함한다. 우리의 특별한 과학적 질문에 대해 고도로 적응 된 방법으로 제시되었지만,이 프로토콜은 다른 기관의 심지어 다른 종의 형광 구조를 완전히 목표로 할 수있는 쉽게 조정 가능한 시스템의 청사진을 나타냅니다.

제시된 LSFM 접근법은 심각한 심근염 유발시 쥐의 심장에서 백혈구 분포와 양을 분석합니다. 그림 1A 는 심근염 유도에 대한 유전자 변형 CD11c.DTR 마우스의 전처리 프로토콜을 설명합니다. 이 단계는 백혈구를 심근에 모집하는 데 필요한 방아쇠를 나타냅니다. 성공적인 DTX 적용 후, 동물들은 일반적인 약점, 식욕 부진 및 2 ~ 4 일 범위의 체중 감소와 같은 심각한 ...

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Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

신경근육학 전기적 자극에 의​​해 근육 트레이닝의 Murine 모델

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

연구

의학

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Model of Wound Healing

상처 치유의 생쥐 모델

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

척수 허혈 - 재관류의 생쥐 모델에서 흉부 대동맥 폐색에 의해 재생산 할 하반신 마비

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

마우스에있는 자기 공명 현미경 영상으로 실험자가 면역 심근염에있는 심장의 이상 유무 비 침습적 평가

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Reproducible Arterial Denudation Injury by Infrarenal Abdominal Aortic Clamping in a Murine Model

쥐 모델에서 Infrarenal 복부 대동맥 클램핑에 의해 재현 동맥 발가 벗김 부상

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These ...

Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening

건설 및 무 균 완화에 CoCrMo 입자에 노출에 의해 Calvarial Osteolysis Murine 모델의 평가

Wear particle-induced osteolysis is a major cause of aseptic loosening in arthroplasty failure, but the underlying mechanism remains unclear. Due to long ...