Name: en face preparation of mouse blood vessels
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Preparation of Mouse Blood Vessels at JoVE.com

Forfatterens forskningsaktiviteter støttes av stipend fra National Institute of Health til Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

Protokollene for mus-partiell carotidarterie-ligering og isolering av musaorta og karotisarterien for immunfarging i ansiktet er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IBT 2014-9231). 1. Venstre Partiell Carotid Artery Ligation <ol><li> Klargjør kirurgisk plass ved å plassere en 12 tommer x 14 tommers varmepute på bordet og dekke pute og bordplaten med en stor, ren kirurgisk drap. Juster armen på bommestativet slik at stereomikroskopets synsfelt ligger i midten av varmeputen. </l...

<ol>
	<li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-'thinned-wall'+preparations.">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li><li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+on+venous+endothelium+of+alterations+in+blood+flow+through+the+vessels+in+vein+walls,+and+the+possible+relation+to+thrombosis.">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li><li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence.">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li><li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+aortic+endothelium.">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li><li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En+face+stripping+of+vascular+endothelium.">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li><li>White, G. E., Gimbrone, M. A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ.">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li><li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress.">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li><li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy.">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e (2012).</li><li>Ch&#232;vre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice.">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li><li>Heo, K. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function.">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li><li>Le, N. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li><li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ.">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li><li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophilin+A+is+an+inflammatory+mediator+that+promotes+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-dependent+mice.">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li><li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice.">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li><li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+fiber+dependent+axial+organization+of+fibronectin+fibrils+in+the+basal+lamina+of+the+chick+and+mesenteric+artery.">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluations+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Når du håndterer museblodkar, er det viktig å huske at endotelet er skjøre, og at enhver overdreven mekanisk kraft vil skade endotelceller. Endotelcellene bryter for eksempel av eller løsner fra karveggen hvis karet blir perfusert for kraftig, noe som lett kan skje når karet blir perfusjonert ved hjelp av en hånddrevet sprøyte. For å oppnå konstant perfusjonstrykk bruker vi et tyngdekraftsperfusjonssystem med 120 cm vannkolonne trykk. Det er blitt rapportert at det gjennomsnittlige...

For histopatologiske studier ved lysmikroskopi behandles tredimensjonale biter av biologiske vev rutinemessig for paraffininduksjon etterfulgt av snitting og farging. En vevsprøve som har blitt paraffin-innebygd, kan være flere millimeter i alle tre dimensjoner. For lysmikroskopi må det imidlertid først snittes slik at lyset kan passere gjennom og deretter farget slik at den tynne delen gir nok kontrast til bildebehandling. Fordi snittprøver vanligvis er 5-10 μm tykkelse, ser man bare en liten del av hele prøven i to dimensjoner av gangen. Det er mulig å samle sekvensielle seksjoner og, etter å ha avbildet hvert enkelt avsnitt, utfører datamaskinassistert rekonstruksjon av 3D-bildene, men dette er en kjedelig jobb. Histopatologi av blodkar, spesielt for å studere patogenesen av aterosklerose, presenterer unike problemer. Aterosklerose er en fokalisert sykdom som utvikler segLokalt i områder hvor forstyrret blodstrøm forekommer. Dessuten initieres sykdommen i intima, et tynt vev bestående av et monolag av endotelceller og ekstracellulær matrise, av store arterier. Av disse årsakene er det en utfordring å lokalisere og studere tidlige lesjoner ved hjelp av seksjonerte blodårer, fordi man lett kan savne snittet av lesjonen. Selv om en seksjon inkluderer et sykt område, vil man kun se en 5-10 μm porsjon som inneholder endotelceller og andre vaskulære veggceller i media og adventitia. Preparasjoner for hele fjellet og ansiktet (uttalte än fäs) gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarets overflate som hele aorta fra aorta rotten helt ned til de vanlige iliac arteriene. Ved å bruke et slikt preparat som er farget med spesifikke antistoffer og andre spesifikke prober, kan man finne plasseringen av lesjoner og også hvor forskjellige molekylære hendelser forekommer i endotelceller i forbindelse medAtherogenesen som forandringer i ekspresjon, lokalisering og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner. I tillegg til å studere atherogenese blir endotelcelleformen observert i en ansiktspreparat brukt som en indikator på det regionale tidsmessige blodstrømningsmønster. Slike data er viktige for å studere mekanosignalering av endotelceller in situ. For dette formål er rutinemessige histologiske tverrsnittede blodkar ikke nyttige. For vaskulær medisin og biologi er det derfor spesielt viktig å skaffe seg en teknikk for å lage ansiktspreparater av blodkar som gjør det mulig å observere et bredt område av fartøyets overflate samt dypere undergrunnsflater av fartøyet. Som gjennomgått av Jelev og Surchev 1 , har vaskulære biologer utviklet ulike metoder for å observere foringen av blodårene i ansiktet. Noen geniale metoder ble utviklet i 1940- og 1950-tallet. Ved hjelp av disse metodene var de<html> Kunne studere den grunnleggende organisasjonen av endotelceller som linje den indre overflaten av blodårene. Imidlertid var det ikke alltid mulig å oppnå uforstyrret morfologisk grunnlag på grunn av måten disse preparatene fremstilles på (den såkalte Hautchen-metoden 2 , 3 , 4 eller avskalling av fartøyets overflate 5 ) og måten prøven ble farget på. Informasjon fra fartøyets overflate til de dypere områdene av blodkarveggen. Hele montering av ansiktsbeholderpreparat kombinert med immunfluorescensfarging tillot oss ikke bare å studere endotelcellemorfologi og proteinuttrykk og lokalisering i disse cellene, men også for å utvide slike studier til den subendoteliale regionen av karvegveggen. Tidlige studier ved bruk av blodkar og ansiktspreparater ble farget immunoflurescently begynte å dukke opp i 1980-tallet 6 ,F &quot;&gt; 7. Med fremkomsten av laserskanning av konfokal mikroskopi og nyere mikrofonmikroskopi, kan man nå skaffe klare in-fokusbilder av blodkarets veggstruktur i immunfluorescently-stained en ansiktsbeholderprøver samt det vaskulære nettverket i levende dyr 8 , 9 , 10 , 11. Disse datamaskinbaserte billedteknikkene skaper optiske snittbilder i fokus og ved å stable slike bilder kan man få rekonstruert 3D-bilder av fartøyets vegg og det vaskulære nettverket i vev. I tillegg er en Kan generere bilder av en seksjon laget langs Z-aksen til det rekonstruerte bildet 12 , 13 . I denne artikkelen vil vi illustrere en metode for å forberede en ansiktspreparat av musaorta og halspulsåren for immunfluorescerende farging. En ansikts forberedelserKan gjøres selv etter at disse fartøyene har blitt manipulert eksperimentelt. For eksempel kan en halspulsårer være delvis ligert og deretter et ansiktspreparat fremstilt etter en slik operasjon. Av denne grunn vil vi også beskrive i denne artikkelen hvordan vi gjør en delvis ligering på halspulsåren. Sammenlignet med å lage lignende preparater fra større dyr som rotter, kaniner og mennesker, er musekar små i størrelse og mer skjøre, hvilket krever ekstra omsorg for håndtering under kirurgisk isolering av kar og forbereder dem for antistofffarging og mikroskopi. Fordi den mest brukte dyremodellen for genetisk modifikasjon er musen, blir det kritisk for mange etterforskere å håndtere muskasser uten å skade dem. I dette manuskriptet vil vi beskrive hvordan du skal håndtere museblodkar når du lager ansiktspreparater av musa aorta og karotisarterie. For demonstrasjonsformål vil vi bruke wild type C57 / b6 mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9788429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12556005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 coated vicryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J833G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488 goat anti-rat IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF546 goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11035</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD555289</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>Sc-8304</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aoto Flow System</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>EZ-AF9000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave Wrap. 24x24in</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>4024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt retractors, 2.5mm wide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18200-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caprofen (Rimadyl)&#160;</td>
			<td>zoetis</td>
			<td>NADA#141-199</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine Scrub, 2%</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXCHLOR2-PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curity gauze sponges 2x2</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>KC2146</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric heating pad, 12X14</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0667724</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass 22x50mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393059</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>Equitech-Bio</td>
			<td>GS05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Solution 4% in PBS</td>
			<td>Santa Cruze Biotechnology</td>
			<td>SC-281692</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes 100x15mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P-36935</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan cortton swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10806-005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puritan Mini cotton tipped aplicators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82004-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round handled Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12076-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture 6/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5601</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strabismus Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14075-09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Grip Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Dressing</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>TD-26C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-1000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC327371000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face preparation of mouse blood vessels

Seksjoner av parafininkonstruert vev blir rutinemessig brukt til å studere vevshistologi og histopatologi. Det er imidlertid vanskelig å avgjøre hva den tredimensjonale vevsmorfologien er fra slike seksjoner. I tillegg kan de undersøkte delene av vev ikke inneholde regionen i vevet som er nødvendig for den pågående studien. Denne sistnevnte begrensningen hindrer histopatologiske studier av blodkar siden vaskulære lesjoner utvikles på en fokalisert måte. Dette krever en metode som gjør at vi kan undersøke et bredt område av blodkarveggen, fra overflaten til dypere områder. En helmontering og ansiktspreparasjon av blodkar oppfyller dette kravet. I denne artikkelen vil vi demonstrere hvordan man gjør ansiktspreparasjoner av musa aorta og karotisarterie og å immunofluorescently flekke dem for konfokal mikroskopi og andre typer fluorescensbasert bildebehandling.

Et typisk en-ansikt immunofluorescensbilde av endotelet er vist i figur 3 . Dette bildet viser en enkelt optisk del av en musaorta tatt nær åpningen av en intercostal arterie (det store mørke eggformede området). Aorta ble dobbeltfarget med anti-VE-kadherin (grønt) og anti-VCAM-1 (vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1) (rødt). Hver endotelcelle er skissert med en grønn lineær farging ved adherensforbindelsen. På grunn av mindre ujevnhet i prøven, er noen adherensfo...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Preparation of Mouse Blood Vessels at JoVE.com

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En fremgangsmåte for fremstilling av ansiktspreparater av muskelkarotidarterien og aorta er beskrevet. Slike preparater, når immunofluorescensfarget med spesifikke antistoffer, gjør det mulig for oss å studere lokalisering av proteiner og identifikasjon av celletyper i hele vaskulærveggen ved konfokal mikroskopi.

En ansiktsbehandling av museblodfartøy

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

Research

JoVE Journal

Biology

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekte Immunfluorescens på Frosne Deler av Mouse melkekjertler

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection av nitrogenoksid og Superoxide i endothelial lag av intakte Arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

Immunofluorescensanalyse av Endogene og eksogene cent-kinetochore Proteiner

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Utarbeidelse av Meiotic kromosom seg fra musen Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...