Name: time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics at JoVE.com

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the 'native' tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

REMARQUE: S&#39;il vous plaît consulter toutes les fiches de sécurité des matières pertinentes (FS) avant utilisation. Fumées produites par ablation au laser de poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) peuvent être toxiques. Assurez-vous que le graveur laser est relié à un système de ventilation du travail. Utilisez toutes les pratiques de sécurité appropriées lors de la construction du dispositif microfluidique, y compris l&#39;utilisation des contrôles techniques (hotte, collecteur de déchets) et de l&#39...

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen/Deuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS/MS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain.">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li><li>Bu&#233;e, L., Bussi&#232;re, T., Bu&#233;e-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. 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Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen/deuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li><li>Engen, J. 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Bien que les méthodes de biologie structurale telles que cristallographie et RMN rayons X sont avantageux car ils fournissent des structures extrêmement détaillées des protéines, ces images sont souvent statiques. La caractérisation des espèces transitoires et les domaines faiblement structurés continue d&#39;être difficile à atteindre quand on l&#39;étudie par ces méthodes conventionnelles. Par conséquent, afin de mieux comprendre dynamiques sur ces types de systèmes, il est important de travailler à des...

Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de techniques analytiques conçues pour mesurer la structure des protéines et de la dynamique 1, 2, 3, 4. Alors que la cristallographie aux rayons X reste le principal outil pour la détermination de la structure des protéines, des concentrations élevées de protéines sont nécessaires est nécessaire et l&#39;optimisation approfondie pour produire des cristaux de qualité de diffraction. Les protéines qui sont difficiles à cristalliser, telles que des protéines associées à la membrane et intrinsèquement désordonnées ont été étudiés de façon classique par échange hydrogène-deutérium (HDX) RMN 5. Toutefois, dans les dernières décennies, le couplage de la spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) à HDX a rapidement gagné en popularité 6, 7. La spectrométrie de masse est une solutionà la plupart des restrictions posées par cristallographie aux rayons X et RMN. En particulier, MS est très sensible (nM à des concentrations uM) nécessaires, et il n&#39;y a pratiquement aucune limite sur la taille des protéines. En outre, le grand cycle de travail d&#39;analyse MS permet la possibilité d&#39;étudier les protéines qu&#39;ils subissent le chiffre d&#39;affaires enzymatique, misfolding, complexation et d&#39;autres processus biologiquement pertinents. Ces processus se produisent souvent sur la milliseconde à la seconde échelle de temps et nécessitent un mélange rapide des réactifs avant l&#39;analyse. Le développement du temps résolu ElectroSpray Ionisation (Trési) par Wilson et Konermann en 2003 des réactions autorisées à surveiller dans le temps pseudo-réel par ESI-MS. Leur configuration incorpore un mélangeur à capillaire avec un volume de chambre de réaction réglable en continu 8. Le dispositif est constitué de deux capillaires concentriques, avec le capillaire interne étanche et d&#39;une encoche découpée dans le côté pour permettre le mélange à l&#39;intérieur de l&#39;espace inter-capillaire étroity espace de l&#39;encoche à l&#39;extrémité du tube capillaire interne (typiquement 2 mm). Lorsqu&#39;il est appliqué à des expériences HDX, le capillaire interne porte la protéine d&#39;intérêt, le capillaire externe porte la solution étiquetage D 2 O, qui subit ensuite le mélange avec la protéine avant d&#39; entrer dans la chambre de réaction réglable permettant d&#39;étiquetage HDX avant le transfert direct dans l&#39;ESI la source. En bref, HDX repose sur squelette hydrogènes d&#39;amide subissant l&#39; échange avec des atomes de deutérium dans la solution 9, 10. L&#39;échange est catalysée par une base à un pH physiologique, avec catalyse acide devenant répandue à un pH inférieur à environ 2,6. Le taux de conversion est basé sur quatre facteurs principaux: pH, température, solvant et de l&#39;accessibilité liaison hydrogène intramoléculaire. Alors que les deux premiers facteurs sont maintenus constants tout au long de l&#39;expérience, le taux de conversion, en particulier au squelette peptidique positions amide, est principalement dependent sur la structure des protéines 11. Régions étroitement pliée avec de vastes réseaux de liaison hydrogène stables dans des hélices a et des feuillets bêta prendra deuterium à des taux sensiblement plus lents par rapport à des boucles et des régions désordonnées (et parfois pas du tout) 12. Cela permet une analyse globale de la protéine, où des perturbations dans la structure (par exemple., Sur l&#39; agrégation ou la liaison au substrat) conduisent à différents absorption de deutérium (Figure 1). Le mélangeur capillaire cinétique peut être incorporé dans une plate-forme microfluidique contenant une chambre protéolytique pour la localisation de l&#39;absorption de deutérium. Cette chambre protéolytique est maintenue à un faible pH afin d&#39;étancher efficacement la réaction d&#39;échange, et nécessite une protéase acide immobilisé afin de digérer la protéine en peptides localisées (figure 2). échange fédérateur de surveillance à milliseconde seconde échelles de temps est particulièrement important pour lala caractérisation des changements conformationnels au sein difficile de caractériser les régions de boucle, des globules fondus, et des protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) de 13, 14. En variante, Trési-HDX peut également être utilisée pour caractériser les protéines qui ne disposent pas de structure atomique résolu par les procédés de cristallographie aux rayons X et RMN, en utilisant l&#39; échange de deutérium couplé à l&#39;algorithme COREX d&#39;approche (DX-COREX) 15, 16. Ce protocole détaillé appliquera Trési-HDX pour étudier la protéine tau, un PCI, tant sa forme native, ainsi que son état hyperphosphorylée pathogène. Alors que la protéine tau native est l&#39; une des personnes déplacées les plus bien étudiés, on sait peu sur son homologue amyloidogène 13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:244px;">Poly(methyl methacrylate) or PMMA</td>
			<td style="width:136px;">Professional Plastics</td>
			<td style="width:145px;">SACR.250CCP</td>
			<td style="width:159px;">8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Fused Silica Glass Capillary</td>
			<td style="width:136px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:145px;">106815-0018</td>
			<td style="width:159px;">ID: 75&#181;m, OD: 150&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Metal Capillaries</td>
			<td style="width:136px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">28 ga &#8211; 89875K97 
			30 ga&#160; - 89875K99</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">1477 
			1548</td>
			<td style="width:159px;">ID: 0.007&#8221;, OD: 1/16&#8221; 
			ID: 0.020&#8221;, OD: 1/16&#8221;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Standard Polymer Tubing Cutter</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">A-327</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; and 1/8&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micro Static Mixing Tee</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">M-540</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">or</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore</td>
			<td style="width:136px;">Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td>
			<td style="width:145px;">ZT1C</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PEEK Tee for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-727</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 Female to Female Luer</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-659</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 PEEK Double-Winged Nut</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-300</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ferrule for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-142</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">100 Series Rotary Tool</td>
			<td style="width:136px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">F013010001</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cut-Off Discs</td>
			<td style="width:136px;">Jobmate</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;">1/64&#8221; thickness</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stereomaster Digital Zoom Microscope</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-563-411</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Soldering Iron</td>
			<td style="width:136px;">Mastercraft</td>
			<td style="width:145px;">58-6301-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">VersaLaser</td>
			<td style="width:136px;">Universal Laser</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Syringes</td>
			<td style="width:136px;">Hamilton</td>
			<td style="width:145px;">81220</td>
			<td style="width:159px;">500&#181;L capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe Pumps</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:145px;">70-4501</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Reagents</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NHS-Activated Agarose</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">26196</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">P6887-250MG</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">151882-10X0.6ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">695092-100ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">HPLC Grade Water</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">W5-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7330-500G</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Phosphate</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S671-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Software/Online Tools</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">CorelDraw X3</td>
			<td style="width:136px;">Corel</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Molecular Weight Calculator</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 6.49</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">mMass</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 5.5.0</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">ExPASy FindPept</td>
			<td style="width:136px;">Swiss Institute of Bioinformatics</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SigmaPlot</td>
			<td style="width:136px;">Systat Software</td>
			<td style="width:145px;">Version 11.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PyMOL</td>
			<td style="width:136px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:145px;">Version 1.5.0.4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:136px;">AB SCIEX</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics

protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) ont longtemps été un défi pour les biologistes structurels en raison de leur manque d&#39;éléments de structure secondaire stable. Hydrogène-deutérium Exchange (HDX) mesurée à des échelles de temps rapide est particulièrement bien adapté pour détecter des structures et des réseaux de liaison hydrogène qui sont brièvement peuplées, permettant la caractérisation de conformères transitoires ensembles natifs. Le couplage de HDX à la spectrométrie de masse offre plusieurs avantages clés, notamment une sensibilité élevée, une faible consommation d&#39;échantillon et aucune restriction sur la taille des protéines. Cette technique a beaucoup progressé au cours des dernières décennies, y compris la possibilité de surveiller HDX temps d&#39;étiquetage à l&#39;échelle de temps de milliseconde. De plus, en intégrant le flux de travail HDX sur une plate-forme microfluidique logeant un microréacteur de protéase acide, nous sommes en mesure de localiser les propriétés dynamiques au niveau du peptide. Dans cette étude, en temps résolu spectrométrie de masse électrospray (Trési-MS) couplé à HDX was utilisé pour fournir une image détaillée de la structure résiduelle de la protéine tau, ainsi que les changements conformationnels induits sur hyperphosphorylation.

des profils de digestion de la protéine tau-phospho native et étaient similaires, ce qui donne une couverture de séquence de 77,1 et 71,7%, respectivement. Les valeurs d&#39;absorption de deutérium de chaque peptide a été déterminée en ajustant les distributions isotopiques observées avec les distributions théoriques générés en utilisant un logiciel développé FORTRAN en interne. Les meilleures distributions de montage sont représentés (figure 3a) ainsi q...

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l&#39;échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Recherche

Biochimie

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Étude de la séquence des protéines - structure-dynamique Relations avec Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Une préparation optimale du formol fixé des échantillons à base de peptides Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

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Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Détection des sites d’ubiquitination des protéines par l’enrichissement du peptide et la spectrométrie de masse

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Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Préparation d’échantillons pour la spectrométrie de masse d’ionisation de l’électrospray de sonde

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Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports

Modélisation de la structure quaternaire par spectrométrie de masse par réticulation chimique: extension des rapports TX-MS Jupyter

Protein-protein interactions can be challenging to study yet provide insights into how biological systems function. Targeted cross-linking mass ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

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Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

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