Name: time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics at JoVE.com

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the 'native' tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

OBS: Kontakta alla relevanta material säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Gaser som bildas av laserablation av poly (metylmetakrylat) (PMMA) kan vara giftiga. Var noga med att lasergravören är ansluten till ett fungerande ventilationssystem. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder när man bygger mikroflödessystem enhet inklusive användning av tekniska kontroller (dragskåp, avfallsbehållare) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, ansiktsmask, handskar, skyddsrock, full längd byxor, slutna t?...

<ol>
	<li>Sapienza, P. J., Lee, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+NMR+to+study+fast+dynamics+in+proteins:+methods+and+applications.">Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).</li><li>Neira, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+as+a+tool+to+identify+and+characterize+protein+folding+intermediates.">NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).</li><li>Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+protein+conformers+be+fractionated+by+crystallization?.">Can protein conformers be fractionated by crystallization?.</a> Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).</li><li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+conformational+landscape+of+a+dynamic+enzyme+by+multitemperature+and+XFEL+crystallography.">Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography.</a> eLife. 4, e07574 (2015).</li><li>Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+uses+of+hydrogen+exchange.">Mechanisms and uses of hydrogen exchange.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).</li><li>Engen, J. R., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+MS.">Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS.</a> Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).</li><li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li><li>Wilson, D. J., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Capillary+Mixer+with+Adjustable+Reaction+Chamber+Volume+for+Millisecond+Time-Resolved+Studies+by+Electrospray+Mass+Spectrometry.">A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).</li><li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).</li><li>Morgan, C. R., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+solution-phase+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphosphorylation+of+intrinsically+disordered+tau+protein+induces+an+amyloidogenic+shift+in+its+conformational+ensemble.">Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble.</a> PloS One. 10, e0120416 (2015).</li><li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid.">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).</li><li>Hilser, V. J., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-based+calculation+of+the+equilibrium+folding+pathway+of+proteins.+Correlation+with+hydrogen+exchange+protection+factors.">Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors.</a> J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Protein+Structural+Models+by+Comparison+of+H/D+Exchange+MS+Data+with+Exchange+Behavior+Accurately+Predicted+by+DXCOREX.">Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).</li><li>Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+microfluidic+chip+for+millisecond+time-scale+kinetic+studies+by+electrospray+mass+spectrometry.">A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).</li><li>Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+reactor+for+rapid,+low-pressure+proteolysis+with+on-chip+electrospray+ionization.">A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).</li><li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro.">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).</li><li>Strohalm, M., Kavan, D., Nov&#225;k, P., Voln&#253;, M., Havl&#237;cek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mMass+3:+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data.">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li><li>Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindPept,+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification.">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).</li><li>Rob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Dynamics+in+Weakly+Structured+Regions+of+Proteins+Using+Microfluidics-Enabled+Subsecond+H/D+Exchange+Mass+Spectrometry.">Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).</li><li>Ferguson, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen/Deuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS/MS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain.">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li><li>Bu&#233;e, L., Bussi&#232;re, T., Bu&#233;e-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+protein+isoforms,+phosphorylation+and+role+in+neurodegenerative+disorders1.">Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1.</a> Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).</li><li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Digestion+Efficiency,+Peptide+Ionization+Efficiency,+and+Sequence+Resolution+for+Protein+Hydrogen/Deuterium+Exchange+Monitored+by+FT-ICR+Mass+Spectrometry.">Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).</li><li>Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+discovery+and+development+-+A+review.">Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review.</a> Anal. Chim. Acta. , (2016).</li><li>Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+and+dynamics+of+interchain+cysteine-linked+antibody-drug+conjugates+as+revealed+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen/deuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry.">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li><li>Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+with+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> The Analyst. 128, 623-628 (2003).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1beta+epitope+mapping+using+site-directed+mutagenesis+and+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry+analysis.">IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis.</a> Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).</li><li>Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes.">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li></ol>

Medan strukturbiologiska metoder såsom röntgenkristallografi och NMR är fördelaktiga eftersom de tillhandahåller extremt detaljerade strukturer av proteiner, dessa bilder är ofta statiska. Karakterisering av transienta arter och svagt strukturerade domäner fortsätter att vara svårfångade när studerats av dessa konventionella metoder. Därför är det för att få dynamiska insikter om dessa typer av system viktigt att arbeta vid snabba tidsskalor. Vi har framgångsrikt tillämpats Tresi-HDX-MS för att få de...

Under de senaste årtiondena, har betydande framsteg gjorts i utvecklingen av analytiska tekniker utformade för att mäta proteinstruktur och dynamik 1, 2, 3, 4. Medan röntgenkristallografi förblir principen verktyg för att bestämma proteinstrukturen, är höga koncentrationer av protein som behövs och omfattande optimering krävs för att producera diffraktion kvalitetskristaller. Proteiner som är svåra att kristallisera, såsom membran-associerade och tätt oordnade proteiner har klassiskt studerats av väte-deuterium utbyte (HDX) NMR 5. Emellertid, under de senaste decennierna, koppling av elektrosprayjonisering masspektrometri (ESI-MS) till HDX har snabbt vunnit popularitet 6, 7. Masspektrometri erbjuder en lösningtill många av de begränsningar som orsakas av röntgenkristallografi och NMR. I synnerhet, är MS högkänslig (nM till pM koncentrationer som erfordras), och det finns praktiskt taget ingen gräns för proteinstorlek. Dessutom kan den höga arbetscykeln för MS-analys ger en möjlighet att studera proteiner som de undergår enzymatisk omsättning, felveckning, komplexbildning och andra biologiskt relevanta processer. Dessa processer förekommer ofta på millisekund till andra tidsskala och kräver snabb blandning av reagens före analys. Utvecklingen av tidsupplöst elektrosprayjonisering (Tresi) av Wilson och KONER i 2003 tillåtna reaktioner övervakas i pseudo-realtid genom ESI-MS. Sina inställningar inkorporerade ett kapillär bländare med en kontinuerligt justerbar reaktionskammarvolymen 8. Anordningen består av två koncentriska kapillärer, med den inre kapillären förseglades och en skåra skuren i dess sida för att medge för blandning inom det smala inter capillary utrymme från skåran till änden av den inre kapillären (typiskt 2 mm). När det appliceras på HDX experiment, den inre kapillären bär proteinet av intresse, bär den yttre kapillären märknings D 2 O lösningen, som därefter genomgår blandning med proteinet före inträdet i justerbara reaktionskammaren medger HDX märkning före direkt överföring in i ESI källa. I korthet, HDX förlitar sig på ryggrads amid väten som genomgår utbyte med deuteriumatomer i lösning 9, 10. Utbytet är baskatalyserad vid fysiologiskt pH, med syra-katalys blir förhärskande vid pH under ca 2,6. Hastigheten för utbytet är baserat på fyra huvudfaktorer: pH, temperatur, lösningsmedelstillgänglighets och intramolekylär vätebindning. Som de tidigare två faktorer hålls konstanta genom hela experimentet, graden av utbyte, i synnerhet vid peptid ryggraden amid positioner, är i första hand dependent på proteinstrukturen 11. Tätt vikta regioner med omfattande, stabila vätebindande nät i a-spiraler och p-ark kommer att ta upp deuterium vid väsentligt lägre hastigheter jämfört med öglor och oordnade områden (och ibland inte alls) 12. Detta medger för global proteinanalys, där störningar i strukturen (t ex., Vid aggregation eller substratbindning) leder till olika deuterium-upptag (Figur 1). Den kinetiska kapillär biandaren kan införlivas i en mikrofluidisk plattform innehållande proteolytisk kammare för lokalisering av deuterium upptag. Denna proteolytiska kammaren hålls vid lågt pH för att effektivt släcka utbytesreaktionen, och kräver en immobiliserad syra proteas för att smälta proteinet in lokaliserade peptider (Figur 2). Övervakning utbyte ryggraden vid millisekund till andra tidsskalor är särskilt viktigt förkarakterisering av konformationsförändringar inom svåra att karakterisera ögleregioner, smälta globuler, och inneboende oordnade proteiner (IDP) 13, 14. Alternativt kan Tresi-HDX också användas för att karaktärisera proteiner som för närvarande inte har en löst atomstruktur genom metoderna för röntgenkristallografi och NMR, med användning av deuterium utbyte kopplad till COREX algoritm (DX-COREX) tillvägagångssätt 15, 16. Denna detaljerade protokoll gäller Tresi-HDX att studera tau, en IDP, i både det ursprungliga form, liksom det är patogena hyperfosforylerat tillstånd. Även infödda tau är en av de mest studerade internflyktingar, lite är känt om dess amyloidogena motsvarighet 13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:244px;">Poly(methyl methacrylate) or PMMA</td>
			<td style="width:136px;">Professional Plastics</td>
			<td style="width:145px;">SACR.250CCP</td>
			<td style="width:159px;">8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Fused Silica Glass Capillary</td>
			<td style="width:136px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:145px;">106815-0018</td>
			<td style="width:159px;">ID: 75&#181;m, OD: 150&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Metal Capillaries</td>
			<td style="width:136px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">28 ga &#8211; 89875K97 
			30 ga&#160; - 89875K99</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">1477 
			1548</td>
			<td style="width:159px;">ID: 0.007&#8221;, OD: 1/16&#8221; 
			ID: 0.020&#8221;, OD: 1/16&#8221;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Standard Polymer Tubing Cutter</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">A-327</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; and 1/8&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Micro Static Mixing Tee</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">M-540</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">or</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore</td>
			<td style="width:136px;">Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td>
			<td style="width:145px;">ZT1C</td>
			<td style="width:159px;">for 1/16&#8221; OD tubing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">PEEK Tee for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-727</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 Female to Female Luer</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">P-659</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">10-32 PEEK Double-Winged Nut</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-300</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ferrule for 1/16&#8221; OD Tubing</td>
			<td style="width:136px;">IDEX</td>
			<td style="width:145px;">F-142</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">100 Series Rotary Tool</td>
			<td style="width:136px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">F013010001</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cut-Off Discs</td>
			<td style="width:136px;">Jobmate</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;">1/64&#8221; thickness</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Stereomaster Digital Zoom Microscope</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-563-411</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Soldering Iron</td>
			<td style="width:136px;">Mastercraft</td>
			<td style="width:145px;">58-6301-2</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">VersaLaser</td>
			<td style="width:136px;">Universal Laser</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Syringes</td>
			<td style="width:136px;">Hamilton</td>
			<td style="width:145px;">81220</td>
			<td style="width:159px;">500&#181;L capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe Pumps</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:145px;">70-4501</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Reagents</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">NHS-Activated Agarose</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">26196</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">Pepsin from Porcine Gastric Mucosa</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">P6887-250MG</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Deuterium Oxide</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">151882-10X0.6ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">695092-100ML</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">HPLC Grade Water</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">W5-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ammonium Acetate</td>
			<td style="width:136px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7330-500G</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sodium Phosphate</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">S671-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Software/Online Tools</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">CorelDraw X3</td>
			<td style="width:136px;">Corel</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Molecular Weight Calculator</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 6.49</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">mMass</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;">Version 5.5.0</td>
			<td style="width:159px;">Open Source MS Tool</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">ExPASy FindPept</td>
			<td style="width:136px;">Swiss Institute of Bioinformatics</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SigmaPlot</td>
			<td style="width:136px;">Systat Software</td>
			<td style="width:145px;">Version 11.0</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PyMOL</td>
			<td style="width:136px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:145px;">Version 1.5.0.4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:244px;">Name</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:159px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Instruments</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:244px;">QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:136px;">AB SCIEX</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics

Egen oordnade proteiner (IDP) har länge varit en utmaning att strukturella biologer på grund av deras brist på stabila sekundära strukturelement. Väte-Deuterium Exchange (HDX) mätt vid snabba tidsskalor är unikt anpassad att detektera strukturer och vätebindningsnätverk som kortfattat är befolkade, vilket möjliggör karaktäriseringen av transienta konformer i nativa ensembler. Koppling av HDX för masspektrometri erbjuder flera viktiga fördelar, inklusive hög känslighet, låg provförbrukning och ingen begränsning på proteinstorleken. Denna teknik har avancerat kraftigt under de senaste årtiondena, inklusive möjligheten att övervaka HDX märkning gånger på millisekundtidsskalan. Dessutom genom att införliva den HDX arbetsflöde på en mikrofluidisk plattform inrymmer en sur proteas mikroreaktor, har vi möjlighet att lokalisera dynamiska egenskaper vid peptidnivån. I denna studie, Time-Resolved elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (Tresi-MS) kopplad till HDX was som används för att ge en detaljerad bild av kvarvarande struktur i tau-protein, såväl som konforma skift inducerats vid hyperfosforylering.

Uppslutnings profiler av nativt och fosfo-tau var liknande, vilket ger en sekvenstäckning av 77,1 och 71,7% respektive. Deuterium upptagsvärdena för varje peptid bestämdes genom att passa de observerade isotopfördelningar med de teoretiska fördelningar som genereras med användning av en egenutvecklad FORTRAN program. Den bäst anpassade fördelningar visas (figur 3a) tillsammans med de tillhörande deuterium upptagningsvärden. Upptags kinetiska profiler genereras...

Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics at JoVE.com

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Konforma flexibilitet spelar en avgörande roll i proteinfunktion. Häri beskriver vi användning av tidsupplöst elektrosprayjoniseringsmasspektrometri kopplad till väte-deuterium utbyte mot sondering de snabba strukturella förändringar som driver funktionen i ordnade och oordnade proteiner.

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersökande Proteinsekvens-struktur-dynamik Förhållanden med Bio3D-webben

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal förberedelse av formalinbeständiga prover för peptid baserat Matrix assisterad Laser Desorption/jonisering masspektrometri Imaging arbetsflöden

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quaternary Structure Modeling Through Chemical Cross-Linking Mass Spectrometry: Extending TX-MS Jupyter Reports

Kvartär strukturmodellering genom kemisk tvärbindning av masspektrometri: Utvidgning av TX-MS Jupyter-rapporter

Protein-protein interactions can be challenging to study yet provide insights into how biological systems function. Targeted cross-linking mass ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

En plattform för vätedeuteriumutbyte av masspektrometri (HDX-MS) för undersökning av peptidbiosyntetiska enzymer

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...