Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
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This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Culture cellulaire et transfection <ol><li> Maintenir le neuroblastome de souris 2a (N2a) , les cellules dans des milieux de croissance. <ol><li> Obtenir 500 ml de milieu de croissance N2a de 200 ml de milieu d&#39;Eagle selon Dulbecco (DMEM) riche en glucose avec 250 ml de sérum réduit support, 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline / streptomycine (100x). </li><li> Maintenir les cellules dans un flacon T75 à 37 ° C dans un...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. 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La sensibilité au pH de septembre permet à des récepteurs se trouvant sur la membrane plasmique à distinguer des récepteurs intracellulaires dans le réticulum endoplasmique, et il peut être utilisé pour résoudre des événements d&#39;insertion de vésicules 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 ...

Les changements dans l&#39; expression du récepteur, la distribution et l&#39; assemblage ont été connectés à une grande variété de maladies, y compris la maladie d&#39;Alzheimer, la maladie de Parkinson, la fibrose kystique et la toxicomanie 1, 2, 3, 4, 5. Par exemple, la nicotine et d&#39; autres ligands nicotiniques influencent le trafic des récepteurs nicotiniques de l&#39; acétylcholine (nAChR) conduisant à des changements dans le trafic, l&#39; expression et la régulation positive 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotine augmente le nombre total de nAChR assemblés dans une cellule, le trafic augmente vers la membrane plasmique, und modifie l&#39;assemblage de sous-unités pour favoriser une version haute sensibilité de certains sous-types. Résoudre des changements distincts dans le trafic, l&#39;assemblage et l&#39;expression des récepteurs dans un modèle de la maladie fournit des détails cruciaux mécanistes qui sont essentielles pour définir des cibles de médicaments. Une approche idéale serait rapidement différencier les récepteurs intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Cela est particulièrement difficile dans les cas où une majorité d&#39;une protéine particulière réside intracellulaire, comme avec nAChR. Puisque la majorité des nAChR sont localisées dans le réticulum endoplasmique, les mesures traditionnelles manquent la résolution spatio-temporelle nécessaire pour identifier la localisation et la traite des changements le long de la voie sécrétoire. Trafic de récepteurs et d&#39; expression des études de nAChR ont principalement été réalisées en utilisant radioligand de liaison 11, des essais de biotinylation 12, western blot 13, ou immunoprécipitation techniq<html> ues 12. Celles-ci dépendent de la spécificité de liaison d&#39;une molécule rapporteur ou la fixation des cellules et ne sont pas capables de distinguer simultanément entre résident de la membrane plasmique et les récepteurs intracellulaires. Par conséquent, les études de montage de canal ionique et vésiculaires dynamique ont largement compté sur les bas-débit techniques électrophysiologiques 14. résolution spatiale et temporelle supérieure est possible avec les progrès de la microscopie par fluorescence. Molécules reporters codés génétiquement, tels que la protéine fluorescente verte (GFP) et ses variantes, d&#39; éliminer les problèmes de liaison non spécifiques et d&#39; augmenter la sensibilité 15. Une variante sensible au pH de la GFP, connu sous superecliptic pHluorin (SEP), peut être utilisé pour exploiter les différences de pH inhérentes entre les compartiments à l&#39; intérieur d&#39; une cellule pour déterminer la localisation 5, 7, 8,ref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. septembre fluoresce lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d&#39; arrêt à un pH inférieur. Par conséquent, les récepteurs marqués avec SEP sur leur côté luminal sont détectés lorsqu&#39;ils sont présents dans le réticulum endoplasmique ( ER) ou lors de l&#39;insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de traite. la manipulation du pH extracellulaire en contact avec des récepteurs sur la membrane plasmique modifie par conséquent la fluorescence et donc la détection de ces récepteurs. Si la même cellule, séquentiellement imagée à la fois à un pH extracellulaire neutre et un pH inférieur à 6, la différence entre les images est attribuée à des récepteurs situés sur la membrane plasmatique. Ceci permet une mesure simultanée de intracellulaire (ER périphérique) et les récepteurs de la membrane plasmique résidentes 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. événements unique d&#39;insertion des vésicules peuvent également être résolus lorsque le pH extracellulaire est neutre. Une fois qu&#39;un faible trafic vésiculaire pH fusionne avec la membrane plasmique, la partie luminale de la vésicule est exposée à la solution extracellulaire neutre, ce qui provoque une transition détectée comme une rafale de fluorescence de 7, 18, 19, 20. Septembre permet la mesure des récepteurs localisés à la membrane plasmique et réticulum endoplasmique périphérique, et fournit un moyen de mesurer le trafic des récepteurs entre ces régions subcellulaires 5, 7, 18. Pour obtenir une résolution plus élevée à la membrane plasmique, avec un récepteur codé génétiquement septembre est imagée par microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM). Cette méthode est particulièrementutile si la plupart des récepteurs sont localisés dans les régions intracellulaires, puisque TIRFM augmente la visibilité de la membrane plasmique. TIRFM permet également la résolution de la dynamique de trafic de vésicules individuelles portant des récepteurs SEP-marqués lors de l&#39;insertion dans le PM. La réflexion totale interne se produit à l&#39;interface des matériaux ayant différents indices de réfraction, par exemple entre une cellule et une lamelle couvre- objet en verre 21, 22. Septembre fluoresce lorsqu&#39;il est irradié par excitation à 488 nm, qui est orientée pour obtenir une réflexion interne totale à l&#39;interface de la solution de verre et de la cellule. Cela produit une onde évanescente qui pénètre environ 150 nm dans l&#39;échantillon, seulement fluorophores passionnantes dans ce volume. Seulement septembre contenant des récepteurs dans un environnement de pH neutre dans cette plage d&#39;excitation sont détectés, correspondant à celles se trouvant sur la membrane plasmique ou réticulum endoplasmique périphérique. Depuis la détection est limitée to excitation par l&#39;onde évanescente, la fluorescence de fond de la région intracellulaire est réduite , et le rapport signal sur bruit est augmenté de 21, 22. En outre, étant donné que le rayonnement ne pénètre pas la majeure partie de la cellule, le photovieillissement est réduite au minimum qui permet l&#39;imagerie des cellules vivantes au cours du temps. En conséquence, TIRFM couplé avec génétiquement codé septembre fournit la haute résolution et la sensibilité requise pour la mesure de localisation et de trafic dynamique subcellulaire des récepteurs membranaires le long de la voie sécrétoire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

Comprendre protéine membranaire traite, l&#39;assemblage et l&#39;expression nécessite une approche qui établit une distinction entre ceux qui résident dans des organites intracellulaires et ceux localisés sur la membrane plasmique. Les mesures classiques basées sur la fluorescence manquent de la capacité de distinguer des protéines membranaires résidant dans différents organites. Méthodologies de pointe dépassent les méthodes traditionnelles de couplage des fluorophores sensibles au pH à la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM). illumination FRBR excite l&#39;échantillon jusqu&#39;à environ 150 nm à partir de l&#39;interface verre-échantillon, diminuant ainsi fond, augmenter le rapport signal sur bruit, et l&#39;amélioration de la résolution. Le volume d&#39;excitation dans TIRFM englobe la membrane plasmique et à proximité des organites tels que l&#39;ER périphérique. Superecliptic pHluorin (SEP) est une version sensible au pH de la GFP. Génétiquement codant septembre dans le domaine extracellulaire d&#39;une protéine membranaire d&#39;intérêt positionne sur le fluorophorele côté luminal du RE et dans la région extracellulaire de la cellule. Septembre est fluorescent lorsque le pH est supérieur à 6, mais reste dans un état d&#39;arrêt à des valeurs de pH inférieures. Par conséquent, les récepteurs marqués avec une fluorescence septembre lorsqu&#39;il réside dans le réticulum endoplasmique (RE) ou lors de l&#39;insertion dans la membrane plasmique (PM), mais pas quand il se trouve dans une vésicule de trafic ou d&#39;autres organites tels que l&#39;appareil de Golgi. Le pH extracellulaire peut être ajustée pour dicter la fluorescence des récepteurs sur la membrane plasmique. La différence de fluorescence entre les images TIRF à pH extracellulaire neutre et acide pour la même cellule correspond à un nombre relatif des récepteurs sur la membrane plasmique. Ceci permet une mesure simultanée de récepteurs résidant intracellulaires et membranaires plasmiques. événements unique d&#39;insertion des vésicules peuvent également être mesurés lorsque le pH extracellulaire est neutre, ce qui correspond à un faible pH vésiculaire de trafic fusionner avec la membrane plasmique et la transition vers un état fluorescent. Cette versatiltechnique de e peut être exploitée pour étudier la localisation, l&#39;expression et le trafic des protéines membranaires.

Septembre incorporation dans un récepteur permet la détection directe de ce récepteur dans une cellule vivante. Couplé à TIRFM, ce qui permet d&#39;évaluer les niveaux d&#39;expression relatifs à la membrane plasmique et la distribution des récepteurs à l&#39;intérieur des emplacements subcellulaires dans la région de l&#39;excitation TIRF. Simples événements de trafic de vésicules peuvent également être résolus. ...

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Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Etiquetage du domaine extracellulaire d&#39;une protéine membranaire avec un fluorophore sensible au pH, superecliptic pHluorin (SEP), permet la localisation subcellulaire, l&#39;expression et le trafic à déterminer. les protéines d&#39;imagerie septembre marqué avec un total de microscopie par fluorescence par réflexion interne (TIRFM) permet la quantification des niveaux de protéine dans la membrane du RE et le plasma périphérique.

Utilisant Receptors pHluorin-taggés pour surveiller Subcellular localisation et le trafic

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

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