Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. תרבות Transfection ניידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור 2a נוירובלסטומה העכבר (N2a) תאי תקשורת צמיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל התקשורת צמיחה N2a מ 200 מ&quot;ל בינוני הנשר של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה, 250 מ&quot;ל מ...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

רגישות pH של ספטמבר מאפשרת קולטנים המתגוררים מופעל על הממברנה להיות נבדלים קולטנים תאי ב reticulum endoplasmic, וזה יכול לשמש כדי לפתור אירועי החדרת קולטן נושאת שלפוחית 5, 7, 8, 9, 18, <sup c...

שינויים בביטוי קולטן, הפצה, והרכבה חוברו למגוון רחב של מחלות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סיסטיק פיברוזיס, והתמכרות לסמים 1, 2, 3, 4, 5. לדוגמא, ניקוטין הליגנדים ניקוטינית אחרים להשפיע על הסחר של קולטני אצטילכולין ניקוטינית (nAChRs) מובילים לשינויים בסחר, ביטוי upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ניקוטין מגדיל את המספר הכולל של nAChRs התאסף בתוך תא, מגביר סחר כלפי הממברנה הפלזמה,ד משנה את ההרכבה של יחידות משנה להעדיף גרסת רגישות גבוהה של תת מסוימים. פתרון שינויים בולטים בסחר, הרכבה, וביטוי של קולטנים מודל המחלה מספק פרטים מכניסטית מכריע כי הם חיוניים כדי להגדיר מטרות תרופה. גישה אידיאלית תהיה להבדיל במהירות בין קולטנים תאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. זה מאתגר במיוחד במקרים בהם רוב של חלבון מסוים מתגורר intracellularly, כגון עם nAChRs. מאחר שרוב nAChRs הם נקודות אל reticulum endoplasmic, מדידות מסורתיות חסרות את הרזולוציה במרחב ובזמן דרושים כדי לאתר שינויי לוקליזציה וסחר לאורך מסלול ההפרשה. מחקרים סחר וביטוי קולטן של nAChRs נערכו בעיקר באמצעות radioligand מחייב 11, מבחני biotinylation 12, 13 סופג המערבי, או techniq immunoprecipitation<html> UES 12. אלה תלויים הסגוליים המחייבים של מולקולת כתב או קיבעון של תאים חסרים את היכולת להבחין בו זמנית בין תושב הממברנה הפלזמה קולטנים תאי. לכן, מחקרים של דינמיקת שלפוחית הרכבת ערוץ היון הסתמכו בעיקר על טכניקות אלקטרו נמוכה תפוקת 14. רזולוציה במרחב ובזמן Superior אפשרית עם התקדמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גנטי מולקולות כתב מקודדות, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), על גרסותיה, תמנע בעיות מחייב ספציפיות ולהגדיל רגישות 15. גרסת pH רגישה של ה- GFP, המכונית pHluorin superecliptic (ספטמבר), שניתן להשתמש בם כדי לנצל הבדלי pH טמונים בין תאים בתוך תא לקבוע לוקליזציה 5, 7, 8,נ&quot;צ &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. ספטמבר מאיר כאשר pH גבוה מ -6, אך נשאר במצב כבוי ב- pH נמוך. לכן, קולטני מתוייגים עם ספטמבר בצד לומינל שלהם מזוהים כאשר נוכח reticulum endoplasmic ( ER) או על הכניסה לתוך קרום התא (PM), אבל לא כאשר מרותק שלפוחית ​​סחר. מניפולציה של ה- pH תאיים במגע עם הקולטנים על קרום התא וכתוצאה מכך משנה את הקרינה ולכן זיהוי של קולטנים אלה. אם לאותו תא ברצף הוא צלם בשתי חומציות תאיים ניטראלית ואז pH נמוך מ -6, ההבדל בין התמונות מיוחסים קולטנים הממוקמים על קרום התא. הדבר זה מאפשר מדידה בו זמנית של תאיים (ER ההיקפי) ואת הקולטנים תושב קרום פלזמה 5, 7, 8 </sup&gt;, 9. אירועי כניסת שלפוחית ​​יחיד יכולים להיפתר גם כאשר pH התאי הוא ניטראלי. פעם שלפוחית סחר pH נמוכה נתיכים עם קרום הפלזמה, צד luminal של שלפוחית חשופת הפתרון הניטראלי התאי, גרימת מעבר זוהה כמו פרץ של קרינה 7, 18, 19, 20. ספטמבר מאפשר המדידה של קולטנים מקומיים על קרום פלזמת reticulum endoplasmic פריפריה, ומספק אמצעי למדידת סחר של קולטנים בין אזורי subcellular אלה 5, 7, 18. כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר על הממברנה הפלזמה, קולטן עם ספטמבר מקודדים גנטי הוא צלם על ידי מיקרוסקופ בתפרחת ההשתקפות הפנימית המוחלט (TIRFM). שיטה זו היא במיוחדשימושי אם רוב הקולטנים הם נקודתיים לאזורים תאיים, מאז TIRFM מגדילה את הנראות של קרום הפלזמה. TIRFM גם מאפשר הרזולוציה של דינמיקת סחר של שלפוחית ​​אחת נושאת קולטנים שכותרתו ספטמבר על להכניסו PM. השתקפות פנימית מוחלטת המתרחשת בבית הממשק של חומרים עם מדדי שבירה שונים, כגון בין תא לבין כיסוי החלקת זכוכית 21, 22. ספטמבר מאיר כאשר מוקרן עם עירור 488 ננומטר, אשר מכוון להשיג השתקפות פנימית מוחלטת על הממשק של פתרון זכוכית תא. זה יוצר גל חולף החודרת כ 150 ננומטר לתוך המדגם, fluorophores מרגש רק בתוך הכרך הזה. רק ספטמבר המכילים קולטני בסביבת pH ניטרלי בטווח זה של עירור מזוהים, המתאימים לאלה המתגוררים על קרום הפלזמה או reticulum endoplasmic הפריפריה. מאז גילוי מוגבל to עירור על ידי הגל החולף, קרינת רקע מהאזור התאי מצטמצם ואת יחס האות לרעש הוא גדל 21, 22. בנוסף, מאז קרינה אינו חודר את חלק הארי של התא, נזקי ממוזער המאפשר הדמיה תא חי במשך זמן. כתוצאה מכך, TIRFM בשילוב עם מקודד גנטית ספטמבר מספק את הרזולוציה והרגישות הגבוהה הנדרשת כדי למדוד הדינמיקה לוקליזציה וסחר subcellular של קולטני קרום לאורך מסלול הפרשה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

סחר חלבון הממברנה הבנה, הרכבה, וביטוי דורשים גישה מבדילה בין גרי אברונים התאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. מדידות קרינה מבוססת מסורתיות חוסר היכולת להבחין חלבונים בממברנה המתגוררים אברונים שונים. מתודולוגיות חוד החנית להתעלות שיטות מסורתיות על ידי צימוד fluorophores pH רגיש עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM). תאורה TIRF שמרגש המדגם עד כ 150 ננומטר מממשק זכוכית מדגם, ובכך להקטין רקע, הגדלת יחס אות לרעש, ושיפור הרזולוציה. היקף עירור TIRFM מקיף קרום הפלזמה האברונים סמוך כגון ER הפריפריה. Superecliptic pHluorin (ספטמבר) הוא גרסת pH רגישה של GFP. גנטי קידוד ספטמבר לתוך התחום התאי של חלבון הממברנה של עניין ממקם את fluorophore עלצד luminal של ER ובאזור התאי של התא. ספטמבר הוא פלורסנט כאשר pH גדול מ -6, אך נשאר במצב כבוי בערכי pH נמוכים. לכן, קולטני מתוייגים עם לזרוח ספטמבר כאשר המתגוררים reticulum endoplasmic (ER) או עם החדרת בקרום פלזמה (PM) אבל לא כאשר מרותק שלפוחית ​​סחר או אברונים אחרים כגון Golgi. ה- pH התאי יכול להיות מותאם כדי להכתיב את הקרינה של קולטנים על קרום התא. ההבדל הקרינה בין תמונות TIRF ב- pH תאיים נייטרלי חומצי לאותו תא מתאים המספר היחסי של קולטנים על קרום התא. זה מאפשר מדידה בו זמנית של קולטנים תושב קרום תאיים ופלזמה. אירועי כניסת שלפוחית ​​יחיד ניתן גם למדוד כאשר pH התאי הוא ניטראלי, המקביל ל שלפוחית ​​סחר pH נמוכה פיוזינג עם קרום הפלזמה ומעבר למצב ניאון. versatil זהטכניקת דואר ניתן לנצל כדי ללמוד לוקליזציה, ביטוי, וסחר של חלבונים בממברנה.

התאגדות ספטמבר לתוך קולטן מאפשרת זיהוי ישיר של קולטן כי בתוך תא חי. יחד עם TIRFM, זה מאפשר הערכה של רמות הביטוי היחסי על קרום התא וחלוקת רצפטורי במקומות subcellular באזור של עירור TIRF. אירועי סחר שלפוחית ​​יחיד יכולים להיפתר גם. <p class="jove_step" fo:keep-together.within-page="...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

ניתוח של SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation וסחר בבני אדם תאים

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...