Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
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This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1.細胞培養およびトランスフェクション<ol><li> 増殖培地中のマウスの神経芽細胞腫2aを（N2aの）細胞を維持。 <ol><li>高グルコースで200mlダルベッコのイーグル培地（DMEM）500からmlのN2aの増殖培地を行い、250mlの血清培地50mlのウシ胎児血清（FBS）を低減し、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（100×）。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター中で37℃でT75フラスコ中の細胞を維?...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

9月のpH感受性は、細胞膜に存在する受容体は、小胞体内の細胞内受容体と区別することができ、挿入イベントを解決するために使用することができる受容体担持小胞5、7、8、9、18、19、20 。結合表面のビオチン化リガ?...

受容体の発現、分布、およびアセンブリにおける変化は、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、および薬物嗜癖1、2、3、4、5を含む様々な疾患に接続されています。例えば、ニコチンおよび他のニコチン性リガンドは、輸送、発現、およびアップレギュレーション1、2、5、6、7、8、9、10の変化をもたらすニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR類）の輸送に影響を与えます。ニコチンは、細胞内で組み立てのnAChRの数を増加させる原形質膜に向けて輸送を増加させますdは、いくつかのサブタイプの高感度版を優先するようにサブユニットのアセンブリを変更します。疾患モデルの人身売買、アセンブリ、および受容体の発現の明確な変化を解決することは薬物標的を定義することが不可欠である重要なメカニズムの詳細を提供します。理想的なアプローチは、急速に細胞内受容体および原形質膜に局在それらの区別になります。これは、特定のタンパク質の大部分は、nAChR類のように、細胞内に存在する場合に特に困難です。 nAChR類の大部分は、小胞体に局在しているので、従来の測定は、分泌経路に沿って局在と人身売買の変化を特定するために必要な時空間的分解能を欠いています。 nAChR類の受容体の輸送および発現の研究は、主に11を放射性リガンド結合を用いて行われてきた、ビオチン化アッセイ12、ウェスタンブロッティング13、または免疫沈降techniq<html> UEの12。これらの細胞のレポーター分子または固定の結合特異性に依存し、同時に細胞膜に常駐し、細胞内受容体を区別する能力を欠いています。したがって、イオンチャネルアセンブリおよび小胞ダイナミクスの研究は、主に、低スループット電気生理学的技術14に依存してきました。 優れた空間的および時間的な分解能は、蛍光顕微鏡法の進歩により可能です。例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその変形などの遺伝的にコードされたレポーター分子は、非特異的結合の問題を排除し、感度15を増加させます。 superecliptic pHluorin（SEP）として知られているGFPのpH感受性変異体は、局在5、 図7、 図8を決定するために、細胞内区画間の固有のpH差を利用するために使用することができREF &quot;&gt; 9、16、17、18。SEPが、pHが6より高い場合に蛍光を発するが、より低いpHで、オフ状態のままであるので、それらの管腔側に9月でタグ付けされた受容体は、小胞体中に存在する場合に検出されます（人身売買の小胞に閉じ込めER）やプラズマ膜（PM）への挿入時に、ではなく。原形質膜上の受容体と接触している外pHの操作は、結果的に蛍光およびこれらの受容体の、したがって検出を変更します。同じセルの場合順次中性外pH 6より低いその後のpHの両方で撮像され、画像の差分が原形質膜上に位置する受容体に起因する。このことは、同時に、細胞内の測定（周辺ER）および原形質膜常駐受容体5を可能にします7,8 </suP&gt; 9。細胞外pHが中性である場合、単一の小胞の挿入イベントも解消することができます。低pH輸送小胞が細胞膜と融合すると、小胞体の内腔側は、蛍光7、18、19、20のバーストとして検出された遷移を引き起こし、中性の細胞外液に露出されます。 SEPが原形質膜および周辺小胞体に局在する受容体の測定を可能にし、これらの細胞内領域5、7、18間の受容体の輸送を測定するための手段を提供します。 形質膜においてより高い解像度を達成するために、遺伝的にコードされた9月との受容体は、全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）によって撮像されます。この方法は、特にです有用TIRFMは、細胞膜の可視性を増大させるための受容体の大部分は、細胞内領域に局在している場合。 TIRFMはまた、PMへの挿入時に9月標識受容体を運ぶ単一小胞の輸送ダイナミクスの解像度を可能にします。全反射は、細胞およびガラスカバースリップ21、22間のような、異なる屈折率を有する材料の界面で起こります。ガラスセルの溶液の界面で全反射を達成するように配向された488nmの励起、照射時SEPが蛍光を発します。これは、試料中にこのボリューム内でのみエキサイティングな蛍光団を150nm程度に浸透するエバネッセント波を生成します。励起のこの範囲内の中性pH環境での受容体を含有するだけで9月には、原形質膜または末梢小胞体に存在するものに対応し、検出されます。検出は限らトンであることからOエバネッセント波によって励起は、細胞内領域からバックグラウンド蛍光が減少し、信号対雑音比は、21、22に増加されます。さらに、細胞の大部分を貫通していない放射ので、光損傷は、時間の経過にわたる生細胞イメージングを可能にする最小化されます。その結果、TIRFMはSEPが分泌経路に沿って膜受容体の細胞内局在性および輸送動力学を測定するために必要な高い分解能と感度を提供し、遺伝的にコードされて結合されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

膜タンパク質輸送、組立、および表現を理解することは、細胞内小器官に存在するものと、原形質膜に局在するものを区別したアプローチが必要です。従来の蛍光ベースの測定は、異なる細胞小器官に存在する膜タンパク質を区別するための能力を欠いています。最先端の方法論は、全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）とpH感受性蛍光色素分子を結合することにより、従来の方法を超越します。 TIRF照明は、このように、バックグラウンドを減少させる信号対雑音比を増加し、解像度を高め、ガラスサンプル界面から約150nmまでのサンプルを励起します。 TIRFMで励起体積は、原形質膜と、周辺ERなどの近くの細胞小器官を含みます。 Superecliptic pHluorin（SEP）は、GFPのpH感受性バージョンです。遺伝的に関心位置の膜タンパク質上の蛍光体の細胞外ドメインに9月をコードしますERの、細胞の細胞外領域内腔側。 SEPが、pHが6よりも大きい場合に蛍光性であるが、より低いpH値ではオフ状態のままです。したがって、（PM）原形質膜に小胞体（ER）または挿入時に常駐している場合には人身売買の小胞または、ゴルジ体などの他の細胞小器官に限定されないときに9月の蛍光を発するのタグが付け受容体。細胞外pHが細胞膜上の受容体の蛍光を決定するように調整することができます。同じセルのための中性および酸性の細胞外pHでのTIRF画像との間の蛍光の差異は、細胞膜上の受容体の相対的な数に対応します。これは、細胞内および細胞膜常駐受容体の同時測定を可能にします。細胞外pHが中性である場合、単一の小胞の挿入イベントはまた、原形質膜と融合し、蛍光状態に移行低pH輸送小胞に相当する、測定することができます。このversatil電子技術は、膜タンパク質の局在化、発現、および輸送を研究するために利用することができます。

受容体への9月の取り込みは、生細胞におけるその受容体の直接検出を可能にします。 TIRFMと相まって、これは、原形質膜とTIRF励起の領域における細胞内位置内の受容体の分布に相対的な発現レベルを評価することができます。単一の小胞輸送のイベントも解決することができます。 細胞膜上の9月で標識された受容体の相?...

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Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

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