Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
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This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. 세포 배양 및 형질 <ol><li> 성장 미디어에서 마우스 신경 모세포종의 2A (N2A) 세포를 유지한다. <ol><li> 높은 혈당 200 ml의 둘 베코의 이글 배지 (DMEM)에서 500 ml의 N2A 성장 미디어를 확인, 250 ml의 혈청 미디어, 50 ml의 소 태아 혈청 (FBS)를 감소, 5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 배). </li><li> 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 T75 플라스크에 세포를 유지한다. </li><li> 분할 세포 1시 15...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

9월의 pH 민감성은 세포막에 존재하는 수용체 소포체에서 세포 수용체와 구별 될 수있게하고, 그 삽입 이벤트를 해결하는 데 사용될 수 수용체 담지 소체 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . 표면 바이오 틸 리간드 등 여러 가지 기술이 널?...

수용체 발현, 배포 및 조립 변화는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 낭포 성 섬유증, 및 약물 중독 1, 2, 3, 4, 5를 포함하여 질병의 다양한 접속되어있다. 예를 들어, 니코틴 및 다른 니코틴 성 리간드 피킹, 식, 및 상향 조절 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10의 변화 선도 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (nAChRs)의 피킹에 영향을 미친다. 니코틴은 셀 내에 조립 nAChRs의 총 개수를 증가 원형질막으로 피킹을 증가시키는D 일부 아형 고감도 버전을 선호 단위체 어셈블리를 변화시킨다. 질병 모델에서 인신 매매, 어셈블리 및 수용체의 발현에 뚜렷한 변화를 해결하는 것은 약물 표적을 정의하는 데 필수적인 중요한 기계적인 세부 사항을 제공합니다. 이상적인 방법은 빠른 속도로 세포 내 수용체와 세포막에 지역화 된 그 구별 것이다. 이것은 특정 단백질의 대부분은 nAChRs와 마찬가지로, 세포 내에서 존재하는 경우에 특히 도전적이다. nAChRs의 대부분 소포체 로컬 라이즈되기 때문에, 기존의 측정은 분비 경로를 따라 위치 파악 및 피킹 변화를 파악하는 데 필요한 공간 - 시간 해상도 부족하다. nAChRs의 수용체 인신 매매와 표현 연구는 주로 11 방사능 리간드 결합, 바이오 틸 분석 (12), 웨스턴 블롯 (13), 또는 면역 침전의 techniq를 사용하여 수행되었다<html> 단말 (12). 이러한 세포의 리포터 분자 또는 고정의 결합 특이성에 의존하는 동시에 세포막 거주자 세포 수용체를 구분할 수있는 능력이 부족하다. 따라서, 이온 채널 조립 및 소포 역학 연구는 크게 낮은 처리량 전기 생리학 기술 (14)에 의존하고있다. 뛰어난 공간 및 시간 해상도는 형광 현미경의 발전으로 가능하다. 이러한 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 그 변종과 같은 유전자 인코딩 된 기자 분자는, 비특이적 결합 문제를 제거하고 감도 (15)을 증가시킨다. superecliptic pHluorin SEP ()로 알려진 GFP의 pH에 민감한 변형은, 현지화 5, 7, 8 결정하는 세포 내 구획 사이 고유의 pH 차이를 악용 할 수 있습니다REF &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. -9 월 pH가 6 이상이되면 형광, 그러나 낮은 pH에서 오프 상태로 유지된다. 따라서, 그 내강 측 9월 태그 수용체 소포체에 존재하는 경우 검출되는 ( 트래픽 관리 소포에 국한 ER) 또는 원형질막 (PM)에 삽입시 아니지만. 세포막에 수용체와 접촉하는 세포 외 pH를 조작하면, 결과적으로 형광이 수용체 따라서 검출 바꾼다. 동일한 셀이면 순차적 중성 세포 외 pH를 6보다 낮은 다음 pH가 양쪽에서 촬상되어 이미지 차이는 세포막에있는 수용체에 기인한다. 이것은, 동시에 세포 측정 (주연 ER) 및 세포막 상주 수용체 5 허용 7,8 </suP&gt; 9. 세포 외 pH가 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 해결 될 수있다. 낮은 pH를 피킹 소포는 세포막과 융합되면 소포의 내강 측 형광 7, 18, 19, 20의 버스트로서 검출 전환을 일으키는 중성 세포 외 용액에 노출된다. -9 월 원형질막 주변 소포체에 국부적 수용체의 측정을 가능하게하고, 이들의 세포 내 영역 5, 7, 18 간 수용체의 피킹을 측정하는 수단을 제공한다. 세포막에서 높은 해상도를 달성하기 위해, 유 전적으로 인코딩 9월와 수용체는 전반사의 형광 현미경 (TIRFM)에 의해 이미징된다. 이 방법은 특히 인유용한 수용체의 대부분은 TIRFM는 세포막의 시인성을 향상하기 때문에, 세포 내 영역에 국부적 인 경우. TIRFM는 오후에 삽입시 9 월 표지 수용체를 들고 하나의 소포의 인신 매매 역학의 해상도를 할 수 있습니다. 전반사는 셀과 유리 커버 슬립 (21, 22) 사이에서 서로 다른 굴절률을 가진 재료의 계면에서 발생한다. 유리 세포 용액의 계면에서 전반사를 달성하기 위해 배향되는 488 nm의 여기, 조사시 -9 월 형광. 이 샘플이 볼륨 내에서만 흥미 진진한 형광으로 약 150 nm의 침투 소멸 파를 생성합니다. 음원이 범위 내에서 중성 pH 환경에서 수용체를 함유 만 9월는 세포막 또는 주변 소포체에있는 것에 대응하는 검출된다. 검출 한정 t이기 때문에세포 내 영역에서 소멸 파, 배경 형광에 의한 O 여기 감소하고 신호대 잡음비가, 22 (21)을 증가시킨다. 또한, 상기 셀의 대부분을 관통하지 않는 방사선 때문에, 광 손상은 시간에 걸쳐 라이브 세포 이미징을 허용하는 최소화된다. 그 결과, SEP를 TIRFM은 분비 경로를 따라 막 수용체의 세포 내 위치 파악 및 피킹 동역학을 측정하기 위해 요구되는 높은 분해능과 감도를 제공 유전자 코드와 결합된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

이해 막 단백질 인신 매매, 조립, 표현은 세포 내 소기관에 거주하는 사람들과 세포막에 지역화 된 그 구별 접근 방식이 필요합니다. 전통적인 형광 기반 측정은 다른 소기관에 존재하는 막 단백질을 구별하는 능력이 부족하다. 최첨단 방법론은 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 pH에 민감한 형광 물질을 결합하여 전통적인 방법을 초월. TIRF 조명 따라서, 배경 감소, 신호 대 잡음 비를 증가하고, 분해능이 향상 글래스 샘플 계면으로부터 약 150 nm의 최대 샘플을 여기시킨다. TIRFM의 여진 볼륨은 주연 ER로 세포막 근처 소기관을 포함한다. Superecliptic pHluorin (-9 월) GFP의 pH에 ​​민감한 버전입니다. 유전자 관심의 세포막 단백질의 세포 외 도메인으로 구월 인코딩하는 형광에 대한 위치 결정을응급실과 세포의 세포 외 영역에서의 내강 쪽. -9 월 pH가 6보다 큰 경우 형광, 그러나 더 낮은 pH 값에서 오프 상태로 남아있다. 따라서, (PM) 플라즈마 막에서 소포체 (ER) 또는 삽입에 거주하는 경우 만 인신 매매 소포 또는 골지 같은 다른 세포 소기관에 국한하지 않을 경우 9월의 형광 태그 수용체. 세포 외 pH를 세포막에 수용체의 형광을 지시하기 위해 조정될 수있다. 동일한 셀의 중성 및 산성 pH에서 세포 TIRF 형광 이미지 간의 차이는 세포막에있는 수용체의 상대적인 수에 대응한다. 이 세포 내와 세포막 거주자 수용체의 동시 측정을 할 수 있습니다. 세포 외 pH가 세포막과 융합 형광 상태로 전환 낮은 산도 피킹 소포에 대응 중성 일 때 단일 소포 삽입 이벤트는 측정 할 수있다. 이 versatil전자 기술은 막 단백질의 현지화, 표현, 인신 매매를 연구하기 위해 이용 될 수있다.

수용체에 9월 법인은 라이브 셀에서 그 수용체의 직접 검출 할 수있다. TIRFM와 결합이 세포막과 TIRF 여기의 영역의 세포 내 위치에서 특정 수용체의 분포에 상대적 발현 수준의 평가를 허용한다. 단일 소포 인신 매매 사건도 해결할 수 있습니다. 플라즈마 멤브레인에 9 월 표지 수용체의 상대 식 수준 <p class="jove_content" fo:keep-to...

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Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

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