Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Культура клеток и трансфекция <ol><li> Поддержание мыши нейробластомы 2a (n2a) клеток в среде для роста. <ol><li> Сделать 500 мл n2a питательной среды от 200 мл среды Дульбекко Eagle (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 250 мл сыворотки снижается носитель, 50 мл фетальной бычьей сыворотк?...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

Чувствительность рН SEP позволяет рецепторы , находящиеся на плазматической мембране , следует отличать от внутриклеточных рецепторов в эндоплазматической сети, и он может быть использован для разрешения вставки событий Рецептор несущих везикулы 5, 7,<...

Изменения в экспрессии рецепторов, распределения и сборки были связаны с широким спектром заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, кистозного фиброза и наркомании 1, 2, 3, 4, 5. Например, никотин и другие никотиновые лиганды влияют на торговлю никотиновых рецепторов ацетилхолина (nAChRs) , что приводит к изменениям в области незаконного оборота, выражения и повышающей регуляцией 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Никотин увеличивает общее количество собранных nAChRs внутри клетки, повышает оборотом к плазматической мембране, А.Н.d изменяет сборку субъединиц в пользу высокой чувствительности версии некоторых подтипов. Решение различных изменений в области незаконного оборота, собраний и экспрессии рецепторов в модели болезни обеспечивает важные механистические детали, которые необходимы для определения целевых наркотиков. Идеальный подход позволил бы быстро проводить различие между внутриклеточными рецепторами и те, локализованный на плазматической мембране. Это особенно сложно в тех случаях, когда большинство конкретного белка проживает внутриклеточно, например, с помощью nAChRs. Поскольку большинство nAChRs локализованы в эндоплазматической сети, традиционные измерения не имеют пространственно-временное разрешение, необходимое для локализации точно определить и незаконного оборота изменений вдоль секреторного пути. Исследования торговли людьми Рецептор и экспрессия nAChRs были в первую очередь были проведены с использованием связывания радиолиганда 11, биотинилирования анализы 12, Вестерн - блоттинга 13 или иммунопреципитация Techniq<html> 12 жает. Это зависит от специфичности связывания с молекулой-репортером или фиксации клеток и не имеют возможности одновременно различать между жителем плазматической мембраны и внутриклеточных рецепторов. Таким образом, исследования сборки ионных каналов и везикул динамика во многом полагались на низкой пропускной способности электрофизиологических методов 14. Улучшенный пространственное и временное разрешение можно с прогрессом в области флуоресцентной микроскопии. Генетически кодируемые репортерные молекулы, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариантов, устранить неспецифическое связывание проблем и повышения чувствительности 15. РН - чувствительного вариант GFP, известный как superecliptic pHluorin (SEP), могут быть использованы , чтобы использовать врожденные различия рН между отсеками внутри ячейки , чтобы определить локализацию 5, 7, 8,Ссылка &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. сентября флуоресцирует при рН выше 6, но остается в выключенном состоянии при более низком рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP на их полостной стороне обнаруживаются , когда присутствует в эндоплазматический ретикулум ( ER), или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда прикован к пузырьку оборота. манипуляции с внеклеточным рН в контакте с рецепторами на плазматической мембране, следовательно, приводит к изменению флуоресценции и, следовательно, обнаружение этих рецепторов. Если в той же клетке последовательно изображается как при нейтральном внеклеточного рН , а затем рН ниже 6, разница между изображениями приписывается рецепторы , расположенные на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной (периферический ER) и рецепторов мембранного резидентные плазмы 5, 7, 8 </suр&gt;, 9. Single вставки пузырек события также могут быть разрешены, когда внеклеточный рН является нейтральным. После того, как низкий везикул оборот рН сливается с плазматической мембраной, полостную часть везикулы подвергается нейтральной внеклеточный раствор, вызывая переход детектируется как взрыв флуоресценции 7, 18, 19, 20. Сентябрем позволяет измерять рецепторами , локализованными на плазменной мембране и периферической эндоплазматической сети, а также предоставляет средства для измерения оборота рецепторов между этими субклеточных областей 5, 7, 18. Для достижения более высокого разрешения на мембране, рецептор с SEP генетически закодированы визуализируется с помощью полного внутреннего отражения микроскопии (цветения TIRFM). Этот метод особеннополезно, если большинство рецепторов локализованы в внутриклеточных областей, так как TIRFM увеличивает видимость плазматической мембраны. TIRFM также позволяет разрешение динамики незаконного оборота одиночных везикул, несущих SEP-меченых рецепторов при введении в ПМ. Полное внутреннее отражение происходит на границе раздела материалов с различными показателями преломления, например, между клеткой и стеклянной крышкой скольжения 21, 22. Сентября флуоресцирует при облучении 488 нм возбуждение, которое ориентировано на достижение полного внутреннего отражения на границе раздела стекла и клеточного раствора. Это производит мимолетную волну, которая проникает примерно 150 нм в образце, только возбуждающих флуорофоров в пределах этого объема. Только Сентябрю рецепторов, содержащих в нейтральной среде рН в указанном диапазоне возбуждения обнаружены, соответствующие тем, которые постоянно находящиеся на плазматической мембране или периферической эндоплазматический ретикулум. Поскольку обнаружение ограничено то возбуждении затухающих волн, фоновой флуоресценции из внутриклеточного области уменьшается , а соотношение сигнал - шум увеличивается 21, 22. Кроме того, поскольку излучение не проникает большую часть клетки, фотоповреждение сведено к минимуму, что позволяет получение изображений живых клеток по сравнению с течением времени. В результате, TIRFM в сочетании с генетически кодируемых Сентябрю обеспечивает высокое разрешение и чувствительность, необходимую для измерения внутриклеточную локализацию и торговлей динамики мембранных рецепторов вдоль секреторного пути.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

Понимание мембраны незаконный оборот белков, сборка и выражение требует такого подхода, который проводит различие между теми, кто живет в внутриклеточных органелл и те, локализованные на плазматической мембране. Традиционные измерения флуоресценции на основе не имеют способность различать мембранных белков, проживающих в разных органеллах. Режущий край методологии выходят за рамки традиционных методов путем сочетания рН-чувствительных флуорофоров с общей микроскопии внутреннее отражение флуоресценции (TIRFM). TIRF освещение возбуждает образец до примерно 150 нм от поверхности раздела стекла и образца, что приводит к снижению фона, увеличивая отношение сигнала к шуму, и повышение разрешения. Объем возбуждения в TIRFM включает плазматическую мембрану и близлежащие органеллы, такие как периферийное ER. Superecliptic pHluorin (SEP) является рН чувствительной версия GFP. Генетически кодирующий SEP в внеклеточный домен мембранного белка, представляющего интерес позиционирует флуорофор наполостную сторона ER и во внеклеточной области клетки. СВП флуоресцентный при рН больше 6, но остается в выключенном состоянии при более низких значениях рН. Таким образом, рецепторы с тэгом SEP флуоресцировать, когда они проживали в эндоплазматический ретикулум (ER) или при введении в плазматической мембране (ПМ), но не тогда, когда ограничивается везикулы людьми или других органеллах, таких как Гольджи. Внеклеточный рН можно регулировать, чтобы диктовать флуоресценцию рецепторов на плазматической мембране. Различие в флуоресценции между TIRF изображений в нейтральной и кислой внеклеточный рН в той же самой клетке соответствует относительному числу рецепторов на плазматической мембране. Это позволяет одновременное измерение внутриклеточной и плазменных мембранных рецепторов резидентов. Одно вставки пузырек события также могут быть измерены, когда внеклеточный рН нейтральна, что соответствует низким везикулы оборота рН сплавленных с плазматической мембраной и перехода в флуоресцентное состояние. Это Versatilе метод может быть использован для изучения локализации, экспрессии и торговлей мембранных белков.

Сентябре включение в рецептор обеспечивает прямое обнаружение этого рецептора в живой клетке. В сочетании с TIRFM, это позволяет оценить относительные уровни экспрессии на плазматической мембране и распределение рецепторов в субклеточных местах в области TIRF возбужде?...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Пометка внеклеточный домен мембранного белка с рН-чувствительного флуорофора, superecliptic pHluorin (SEP), позволяет внутриклеточной локализации, выражение, и незаконный оборот подлежит определению. Визуализации SEP-меченых белков с полным внутренним отражением флуоресцентной микроскопии (TIRFM) позволяет количественно оценить уровни белка в периферической ER и плазматической мембраны.

Используя pHluorin-маркированные Рецепторы для мониторинга субклеточных локализации и торговли

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Сотовые к клетке высокомолекулярных транспорта Пробирной В Планта Используя Biolistic Бомбардировка

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Желудочно-монитор подвижность (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Нано-FEM: Белка Локализация с использованием фото-активированного микроскопии локализации и электронная микроскопия

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Методы оценки субклеточных отсеков Muscle в<em&gt; С. Элеганс</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Высокое разрешение метод контроля Фосфорилирование-зависимая активация IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Анализ СПДК<em&gt; N</em&gt; -glycosylation И торговле человеческими клетками

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Производство и визуализация бактериальный Spheroplasts и протопласта характеризуют антимикробного пептида локализации

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...