Name: utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking
Uploaded: 2017-03-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu <ol><li> Büyüme ortamı fare nöroblastom 2a (N2a) hücreleri korumak. <ol><li> Yüksek glikoz 200 mi Dulbecco&#39;nun Eagle ortamında (DMEM) 500 mi N2a büyüme ortamı yapmak, 250 mi, serum ortamı, 50 ml cenin sığır serumu (FBS), düşük ve 5 ml penisilin / streptomisin (100 X). </li><li> % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de bir T75 şişesi içinde hücreleri korumak. </li><li> Bölünmüş hücreler 01:15 gerektiğinde, ya da yaklaşık%...

<ol>
	<li>Lester, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+is+a+selective+pharmacological+chaperone+of+acetylcholine+receptor+number+and+stoichiometry.+Implications+for+drug+discovery.">Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery.</a> AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).</li><li>Henderson, B. J., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inside-out+neuropharmacology+of+nicotinic+drugs.">Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs.</a> Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).</li><li>Banerjee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+in+the+temporal+cortex+in+Alzheimer's+and+Parkinson's+disease--a+stereological+approach.">Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach.</a> Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).</li><li>Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+&#946;-amyloid+levels+in+early+alzheimer+disease.">Cortical &#945;7 nicotinic acetylcholine receptor and &#946;-amyloid levels in early alzheimer disease.</a> Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).</li><li>Richards, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+&#945;4*+Nicotinic+Receptors+Revealed+by+Superecliptic+Phluorin.">Trafficking of &#945;4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin.</a> J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).</li><li>Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+acts+as+a+pharmacological+chaperone+to+up-regulate+human+a4b2+acetylcholine+receptors.">Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors.</a> Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).</li><li>Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nicotine+metabolite,+cotinine,+alters+the+assembly+and+trafficking+of+a+subset+of+nicotinic+acetylcholine+receptors.">The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors.</a> J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+exploits+a+COPI-mediated+process+for+chaperone-mediated+up-regulation+of+its+receptors.">Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors.</a> J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).</li><li>Henderson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Menthol+Alone+Upregulates+Midbrain+nAChRs,+Alters+nAChR+Subtype+Stoichiometry,+Alters+Dopamine+Neuron+Firing+Frequency,+and+Prevents+Nicotine+Reward.">Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward.</a> J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).</li><li>Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+trafficking+of+CFTR+in+health+and+disease.">Endocytic trafficking of CFTR in health and disease.</a> J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).</li><li>Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+nicotine+and+mecamylamine+treatment+increase+brain+nicotinic+receptor+binding+without+changing+alpha+4+or+beta+2+mRNA+levels.">Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels.</a> J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).</li><li>Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-induced+upregulation+of+native+neuronal+nicotinic+receptors+is+caused+by+multiple+mechanisms.">Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms.</a> J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).</li><li>Mazzo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine-modulated+subunit+stoichiometry+affects+stability+and+trafficking+of+alpha3beta4+nicotinic+receptor.">Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor.</a> J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).</li><li>Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;4&#946;2+nicotinic+receptors+with+high+and+low+acetylcholine+sensitivity:+pharmacology,+stoichiometry,+and+sensitivity+to+long-term+exposure+to+nicotine.">&#945;4&#946;2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine.</a> Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).</li><li>Khiroug, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+membrane-inserted+fraction+of+pHluorin-tagged+channels+using+repetitive+acidification+technique.">Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique.</a> BMC Neurosci. 10 (141), (2009).</li><li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q/R+editing+of+the+ion+pore.">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).</li><li>Yudowski, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors.">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).</li><li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist.">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Internal+Reflection+Fluorescence+Microscopy.">Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.</a> Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).</li><li>Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pH+of+the+secretory+pathway:+measurement,+determinants,+and+regulation.">The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation.</a> Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).</li></ol>

SEP pH duyarlılığı, plazma zarı üzerinde bulunan reseptörler endoplazmik retikulum hücre içi reseptörler ayırt edilmesini sağlar ve sokma olayları çözmek için kullanılabilen reseptör taşıyan veziküller 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Yüzey biyotinilasyon ve ligand dahil olmak...

Reseptör ifadesi, dağıtım, ve montaj değişiklikler Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kistik fibroz, ve madde bağımlılığı, 1, 2, 3, 4, 5 dahil olmak üzere hastalıkların geniş bir yelpazede bağlı olmuştur. Örneğin, nikotin ve nikotinik ligandlar kaçakçılığı, ifadesi ve yukarı doğru düzenleme, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 değişikliklere yol nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR&#39;ler) kaçakçılığı etkilemektedir. Nikotin, bir hücre içinde bir araya nAChR&#39;lerin sayısı artar, plazma zarının kaçakçılığı artırand bazı alt tiplerinin yüksek hassasiyet sürümünü lehine alt birimlerinin montajını değiştirir. bir hastalık modelinde kaçakçılığı, montaj ve reseptörlerin ifadesinde belirgin değişiklikler çözümleniyor ilaç hedefleri tanımlamak için gerekli olan çok önemli mekanistik ayrıntıları sağlar. Ideal bir yaklaşım hızla hücre içi reseptörler ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında ayrım olur. Bu, belirli bir proteinin bir çoğunluğu bu nAChR&#39;lerle gibi, hücre bulunduğu durumlarda, özellikle zordur. nAChR&#39;lerin çoğunluğu endoplazmik retikulum lokalize olduğundan, geleneksel ölçümler salgı yolu boyunca lokalizasyonu ve kaçakçılık değişikliklerini saptamak için gerekli uzay-zamansal çözünürlüğe yoksundur. NAChR&#39;lerin Reseptör kaçakçılığı ve anlatım çalışmaları öncelikle 11 Radyogland bağ, biyotinilasyon deneyleri 12, batı lekeleme 13 veya immünopresipitasyon techniq kullanılarak yapılmıştır<html> ues 12. Bu hücreler, bir raportör molekülü veya tespitin bağlama spesifikliği bağlıdır ve aynı zamanda plazma zarı yerleşik ve hücre içi reseptörler ayırt kabiliyetinden yoksundur. Bu nedenle, iyon kanal montaj ve vezikül dinamikleri çalışmalar büyük ölçüde düşük verimlilik elektrofizyolojik teknikler 14 yararlanmıştır. Üstün mekansal ve zamansal çözünürlükte floresan mikroskobu gelişmeler ile mümkündür. , Yeşil flüoresan protein (GFP) ve türevleri gibi genetik olarak kodlanmış raportör moleküller, spesifik olmayan bağlama sorunları ortadan kaldırmak ve hassasiyeti 15 artar. Superecliptic pHluorin (SEP) olarak bilinen GFP bir pH duyarlı varyantı, yeri 5, 7, 8 belirlemek için, hücre içinde bölmeler arasında doğal pH farklılıkları yararlanmak için kullanılabilecekref &quot;&gt; 9, 16, 17, 18. Eylül pH 6 daha yüksek olduğunda fluoresces, ancak daha düşük pH değerlerinde bir kapalı durumda kalır. Bu nedenle, lümen tarafında SEP ile etiketlenmiş reseptörleri endoplazmik retikulumda mevcut olduğunda tespit edilir ( bir trafik kesecik sınırlı ER) veya plazma zarı (PM) içine sokulması üzerine, ancak., plazma zarı üzerinde reseptörleri ile temas ekstrasellüler pH manipülasyonu sonuç olarak floresans ve bu reseptörlerin nedenle algılama değiştirir. aynı hücre halinde ardışık olarak nötr ekstrasellüler pH ile 6 daha düşük daha sonra bir pH hem de görüntülenmiş olan, görüntü arasındaki fark, plazma membranı üzerinde bulunan reseptörlere bağlanabilir. Bu, aynı anda hücre içi ölçümünü (periferik ER) ve plazma membran yerleşik reseptörleri 5 karşılaştırın 7, 8 </sup&gt; 9. hücre dışı pH nötr olduğunda tek vezikül ekleme olaylar da çözülebilir. Düşük pH trafik vezikül plazma membranı ile kaynaştıran sonra, vesikül luminal tarafında floresan 7, 18, 19, 20 bir patlama olarak algılanabilir bir geçiş neden nötr hücre dışı çözeltiye maruz bırakılır. Eylül plazma membranı ve periferik endoplazmik retikulum lokalize reseptörlerin ölçüm sağlar ve bu hücre içi bölgelerde 5, 7, 18 arasında reseptörlerinin kaçakçılığı ölçmek için bir araç sağlar. plazma membranında yüksek çözünürlük elde etmek için, genetik olarak kodlanmış SEP ile reseptör toplam iç yansıma florasan mikroskobu (TIRFM) tarafından görüntülü. Bu yöntem, özellikle biryararlı reseptörlerin çoğunluğu TIRFM plazma zarı görünürlüğünü arttırır, çünkü hücre içi bölgelere lokalize ise. TIRFM da PM içine sokulması üzerine Eylül-etiketli reseptörleri taşıyan tek veziküllerin kaçakçılığı dinamiklerinin çözünürlüğü sağlar. Toplam iç yansıma bir hücre ve bir cam kapak-slip 21, 22 arasında olduğu gibi, farklı kırılma indislerine sahip malzeme ara yüzeyinde meydana gelir. Cam ve hücre çözümü arayüzünde toplam iç yansıma elde aydınlatmaktadır 488 nm uyarma, ışınlanmış zaman Eylül fluoresces. Bu örnek, bu hacmin içinde sadece heyecanlı fluorophores içine yaklaşık 150 nm nüfuz bir evanescent dalga üretir. ikaz bu aralık içinde nötr pH ortamında reseptörleri içeren sadece Eylül plazma membranı veya periferik endoplazmik retikulum üzerinde bulunan kişilerce karşılık gelen tespit edilir. algılama sınırlı t olduğundanhücre içi bölge kaybolan dalga eşiğe göre O uyarım azalır ve sinyal gürültü oranı, 22 21 arttırılır. Buna ek olarak, hücre toplu nüfuz etmez ışıma, fotohasar zaman içinde canlı hücre görüntüleme sağlayan en aza indirilir. Bunun bir sonucu olarak, TIRFM Eylül salgı yolu boyunca membran reseptörlerinin hücre içi lokalizasyonu ve trafik dinamikleri ölçmek için gerekli olan yüksek çözünürlük ve hassasiyet sağlayan genetik olarak kodlanmış ile birlikte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="861">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Reagent/Material</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:413px;">35 mm glass bottom petri dishes, sterile</td>
			<td style="width:163px;">Cell E&#38;G</td>
			<td style="width:119px;">GBD00002-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:163px;">vwr</td>
			<td align="right">215017510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco Modified Eagle Medium&#8206; (DMEM), High Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>11-965-084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td>16-000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:413px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:163px;">Gibco / Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21083027</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Lipofectamine</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11668030</td>
			<td>Gently mix; Do not vortex</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>P217-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D16-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective immersion oil&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Equipment</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Camera</td>
			<td style="width:163px;">Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">60x, 1.49 NA oil immersion objective</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td>APON 60XOTIRF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized stage</td>
			<td style="width:163px;">Prior</td>
			<td>IXPROXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Motorized actuator (stepper motor)</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td>ZST213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">MetaMorph (or other imaging program)</td>
			<td style="width:163px;">Metamorph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">488 nm laser</td>
			<td style="width:163px;">Market Tech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Single mode fiber</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">SM450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Mirrors</td>
			<td style="width:163px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">BB1-E01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dichroic 488 nm LP</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>Di02-R488-25x36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 488 nm</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>LL01-488-12.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Bandpass filter, 525/50</td>
			<td style="width:163px;">Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing phluorin-tagged receptors to monitor subcellular localization and trafficking

Anlamak membran proteini kaçakçılığı, montaj ve ifade hücre içi organellerin kalanların ve plazma membran üzerinde lokalize olanlar arasında farklılık bir yaklaşım gerektirir. Geleneksel floresan bazlı ölçümler farklı organellere ikamet eden zar proteinleri ayırt yeteneği yoksundur. Kesici kenar metodolojileri toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile pH-duyarlı fluorophores bağlanmasıyla geleneksel yöntemlerle aşmak. TIRF aydınlatma, böylece arka plan azalan sinyal gürültü oranını artırmak ve çözünürlük arttırıcı, cam numunesi arayüzünden 150 nm&#39;ye kadar örnek uyarılmaktadır. TIRFM içinde uyarma hacmi gibi periferik ER olarak plazma zarı ve yakındaki organelleri kapsar. Superecliptic pHluorin (SEP) GFP pH&#39;ya duyarlı bir versiyonudur. Genetik olarak ilgi konusu bir membran proteini hücre dışı etki alanına SEP kodlayan fluorofor ile ilgili pozisyonlarıER ve hücre dışı bölgesinde lümen taraf. Eylül pH, 6 daha büyük olduğu zaman, floresan, ancak daha düşük pH değerlerinde kapalı durumda kalır. Bu nedenle, (PM) plazma membranında endoplazmik retikulum (ER) &#39;de ya da sokulması üzerine bulunan ancak bir trafik vezikül veya Golgi gibi diğer organellere sınırlı değilken Eylül floresan ile etiketlenmiş reseptörleri. ekstrasellüler pH, plazma zarı üzerinde reseptörlerin floresan dikte ayarlanabilir. Aynı hücre için nötr ve asidik hücre dışı pH TIRF görüntüleri arasında floresan farkı, plazma zarı üzerinde reseptör göreli sayısına karşılık gelir. Bu hücre içi ve plazma zarı ikamet reseptörlerinin bir ölçümünü sağlar. ekstrasellüler pH plazma membranı ile füzyonu bir floresan haline geçiş, düşük pH trafik vezikül tekabül eden nötr olduğunda tek vezikül yerleştirme etkinlikleri de ölçülebilir. bu versatilE tekniği membran proteinlerinin lokalizasyonu, ifade ve ticaretini incelemek için kullanılabilir.

Bir reseptör olarak Eylül dahil canlı bir hücreye reseptörün doğrudan tespit edilmesine olanak sağlar. TIRFM ile birleştiğinde, bu plazma zarı ve TIRF uyarma bölgede hücre içi yerlerinizdeki reseptörlerin dağılımı üzerindeki bağıl ifade seviyelerinin değerlendirilmesini sağlar. Tek vezikül kaçakçılığı olayları da çözülebilir. Plazma Zarında Eylül-etiketli Reseptör göreli İfade Düzeyleri </...

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking at JoVE.com

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pH&#39;ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Gastrointestinal Motilite Monitör (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Scap analizi<em&gt; K</em&gt; İnsan Hücreleri -glycosylation ve Ticareti

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Canlı hücre görüntüleme modları giriş ve Antifungal bitki Defensins hücre altı yerelleştirme araştırmak için mantar hücrelerinin

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

Üretim ve bakteriyel Spheroplasts ve önceki antimikrobiyal peptid yerelleştirme karakterize etmek için görselleştirme

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...