Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00
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Nous remercions le Dr Ricardo Dolmetsch (Faculté de médecine de l&#39;Université de Stanford, affiliation actuelle: Novartis Institutes for Biomedical Research) pour aider à développer cette analyse et le Dr Matthew Wood, Takuma Aihara et Dongsook Kim pour leur lecture critique du manuscrit.

Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l&#39;approbation du Comité d&#39;aide et de protection des animaux de l&#39;Université de Tsukuba (IACUC). 1. Dissection <ol><li> Pour préparer les jours embryonnaires 13-14 ICR ou C57BL / 6, éuthanaser les souris enceintes par dislocation cervicale. Retirez l&#39;utérus et placez-le dans une boîte de Petri avec Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Rincez-le bien pour enlever le sang. </li><li> En utilisant une pince, t...

<ol>
	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Ce protocole introduit la procédure de quantification de la motilité des vésicules. Dans les neurones primaires, les endosomes et les lysosomes ont tendance à présenter une motilité élevée chez les neurones plus jeunes (4-6 DIV). Étant donné que les neurones doivent fournir certains composants aux bords d&#39;attaque pour allonger les processus neuronaux, le trafic membranaire devrait se produire dynamiquement pendant cette étape. Ainsi, il est important d&#39;utiliser des neurones plus jeunes pour observer l...

Un contrôle précis du trafic d&#39;endosome-lysosome est indispensable pour réguler la fonction neuronale. Notamment, les mouvements dynamiques de ces vésicules sont un facteur clé qui sous-tend la régulation de la morphologie, du développement et de la survie des neurones. Les défauts dans ce système provoquent des troubles neuronaux sévères 1 , 2 . Les mécanismes moléculaires qui relient le trafic de vésicules aux maladies neuronales sont considérés comme compliqués, et plusieurs groupes ont cherché à examiner cette pertinence. Par exemple, il a été signalé que la motilité perturbée de l&#39;endosome tardif est significativement associée à la maladie de Niemann-Pick C 3 , un trouble neurodégénératif héréditaire causé par des défauts de lysosome. Un autre exemple est une mutation dans un canal lysosomal Ca 2+ , trpml 1, qui altère la motilité lysosomale, entraînant des maladies de stockage lysosomique 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Notre groupe a signalé que la dysrégulation du renouvellement de PtdIns (3,5) P 2 supprime la motilité de l&#39;endosome et du lysosome dans les neurones, entraînant une augmentation de la vulnérabilité à la réponse au stress 7 , 8 . La régulation métabolique de PtdIns (3,5) P 2 , qui se localise principalement sur les endosomes tardifs et les lysosomes, joue un rôle important dans une grande variété de fonctions cellulaires, y compris le trafic de vésicules et les processus de fusion-fission 9 , 10 . Étant donné que le renversement de PtdIns (3,5), le renouvellement de P 2 provoque une neurodégénérescence grave 11 , 12 , la régulation aberrante de la motilité de l&#39;endosome-lysosome pourrait être un facteur clé pour comprendre la pathogenèse de la neurodégénérescence. Une enquête sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la motilité des vésicules peut donc fournir des indices prometteurs qui peuvent approfondir notre volontéRépétation de plusieurs troubles neuronaux. Dans cet article, nous introduisons une méthode précieuse pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones à l&#39;aide d&#39;un logiciel gratuit appelé Manuel Tracking. L&#39;objectif était de développer une méthode de quantification rapide pour analyser la motilité des vésicules. Cette quantification est dirigée par une approche standard de cliquer sur un point de référence dans chaque image d&#39;un film temporel. L&#39;utilisation du logiciel de suivi manuel rend cette approche assez simple et d&#39;une large utilité, contrairement à d&#39;autres applications. En outre, cette approche s&#39;applique également aux autres cellules, telles que les cellules gliales. Bien que cette méthode soit primitive, elle peut être appliquée à diverses analyses, y compris la motilité cellulaire et les changements morphologiques. Par exemple, après avoir défini un point de référence sur une séquence d&#39;images, les informations sur les positions des points de référence et l&#39;heure à chaque position peuvent être extraites à partir d&#39;images séquentielles en utilisant l&#39;analyse de données et le traitement d&#39;image douxWare. Ensemble, cette méthode est simple mais puissante et contribue au développement d&#39;une efficacité améliorée dans les études basées sur le trafic membranaire, telles que celles qui examinent la fonction endosome-lysosome.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptmycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine &#34;Max&#34;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24765</td>
			<td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOREVO BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation system INUG2-K13</td>
			<td>Tokay Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel version 15</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ verion 1.47</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

Dans le cerveau, les systèmes de trafic membranaire jouent un rôle important dans la régulation des fonctions neuronales, telles que la morphologie neuronale, la plasticité synaptique, la survie et les communications gliaires. À ce jour, de nombreuses études ont rapporté que les défauts dans ces systèmes provoquent diverses maladies neuronales. Ainsi, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la dynamique des vésicules peut fournir des indices influents qui pourraient aider au traitement de plusieurs troubles neuronaux. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier les motilités de vésicules, telles que la distance de motilité et le taux de mouvement, en utilisant un plug-in logiciel pour la plate-forme ImageJ. Pour obtenir des images pour la quantification, nous avons identifié des structures d&#39;endosome-lysosome neuronaux avec des protéines marqueurs de vésicules etiquées par EGFP et observé le mouvement des vésicules à l&#39;aide d&#39;un microscopie temporelle. Cette méthode est très utile et simplifie la mesure de la motilité des vésicules dans les neurites, comme les axones et les dendrites, ainsi que dans le soma des neurones et des cellules gliales. FurthermoRe, cette méthode peut être appliquée à d&#39;autres lignées cellulaires, telles que les fibroblastes et les cellules endothéliales. Cette approche pourrait apporter un précieux progrès à notre compréhension du trafic de la membrane.

Ce test a été conçu pour mesurer la dynamique des vésicules dans la culture in vitro . Ce dosage a été utilisé pour déterminer la motilité des vésicules associée à la morphologie neuronale et à la survie. Les figures 1A et B montrent des données représentatives montrant la motilité du lysosome dans les neurones. Les neurones corticaux ont été transfectés avec le marqueur de lysosome, LAMP-EGFP, et ont été observés ...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

L&#39;étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C&#39;est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

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Neuroscience

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