Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00
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Ringraziamo il dottor Ricardo Dolmetsch (Stanford University School of Medicine, presente affiliazione: Istituti Novartis per la Ricerca Biomedica) per contribuire a sviluppare questa analisi e il dottor Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim per la loro lettura critica del manoscritto.

Tutte le procedure animali sono state eseguite con l&#39;approvazione dell&#39;Università di Tsukuba Animal Care and Use Committee (IACUC). 1. Dissezione <ol><li> Per preparare il giorno embrionale 13-14 ICR o C57BL / 6 feti, eutanizzare i topi incinte con dislocazione cervicale. Rimuovere l&#39;utero e metterlo in un piatto di Petri con Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Sciacquarlo bene per rimuovere il sangue. </li><li> Usando le pinze, trasferire l&#39;utero in un nuovo piatto ...

<ol>
	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Questo protocollo introduce la procedura per quantificare la motilità della vescicola. Nei neuroni primari, endosomi e lisosomi tendono a mostrare un&#39;elevata motilità nei neuroni più giovani (4-6 DIV). Dato che i neuroni devono fornire alcuni componenti ai bordi principali per allungare i processi neurali, il traffico di membrana dovrebbe verificarsi dinamicamente durante questa fase. Quindi, è importante utilizzare i neuroni più giovani per osservare la motilità dinamica nei dendriti neuronali. Inoltre, le ve...

Il controllo preciso del traffico endosomi-lisosomi è indispensabile per la regolazione della funzione neuronale. In particolare, i movimenti dinamici di queste vescicole sono un fattore chiave alla base della regolazione morfologica, dello sviluppo e della sopravvivenza neuronale. I difetti in questo sistema causano gravi disordini neuronali 1 , 2 . I meccanismi molecolari che collegano il traffico di vescicole alle malattie neuronali sono considerate complicate e diversi gruppi hanno cercato di esaminare questa rilevanza. Ad esempio, è stato riportato che la motilità endoteliale tardiva perturbed è significativamente associata alla malattia di Niemann-Pick C 3 , un disordine neurodegenerativo ereditato causato da difetti lisosomi. Un altro esempio è una mutazione in un canale lizosomico Ca 2+ , trpml 1, che danneggia la motilità lisosomica, con conseguente malattia di stoccaggio lisosomiale 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Il nostro gruppo ha riferito che la disregolazione del turnover di PtdIns (3,5) P 2 elimina la motilità endosoma e lisosomica nei neuroni, portando ad un aumento della vulnerabilità alla risposta allo stress 7 , 8 . La regolazione metabolica di PtdIns (3,5) P 2 , che localizza principalmente in endosomi tardivi e lisosomi, svolge un ruolo importante in un&#39;ampia varietà di funzioni cellulari, tra cui la trattazione di vescicole e processi di fusione-fissione 9 , 10 . Poiché la perdita di turnover PtdIns (3,5) P 2 causa una grave neurodegenerazione 11 , 12 , la regolazione aberrante della motilità endosoma-lisosomica potrebbe essere un fattore chiave per comprendere la patogenesi della neurodegenerazione. Un&#39;analisi dei meccanismi molecolari che sottostanno la motilità della vescicola possono quindi fornire suggerimenti promettenti che possono approfondire la nostra undeDi diversi disturbi neuronali. In questo articolo introdurremo un metodo prezioso per quantificare la motilità delle vescicole nei neuroni usando un pacchetto software libero chiamato Tracking manuale. Lo scopo era sviluppare un metodo di quantificazione rapida per analizzare la motilità della vescicola. Questa quantificazione è diretta attraverso un approccio standard di clic su un punto di riferimento in ogni fotogramma di un film a tempo trascorso. L&#39;utilizzo del software di monitoraggio manuale rende questo approccio molto semplice e di grande utilità, a differenza di altre applicazioni. Inoltre, questo approccio è applicabile anche ad altre cellule, come le cellule gliali. Anche se questo metodo è primitivo, può essere applicato a varie analisi, tra cui la motilità cellulare e il cambiamento morfologico. Ad esempio, dopo aver definito un punto di riferimento in una sequenza di immagini, le informazioni sulle posizioni dei punti di riferimento e l&#39;ora in ogni posizione possono essere estratti da immagini sequenziali utilizzando l&#39;analisi dei dati e l&#39;elaborazione delle immagini software. Considerati insieme, questo metodo è semplice ma potente e contribuisce allo sviluppo di una maggiore efficienza negli studi basati sul traffico di membrana, come quelli che esaminano la funzione endosomi-lisosomi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptmycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine &#34;Max&#34;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24765</td>
			<td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOREVO BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation system INUG2-K13</td>
			<td>Tokay Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel version 15</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ verion 1.47</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

Nel cervello, i sistemi di traffico di membrana svolgono un ruolo importante nella regolazione delle funzioni neuronali, come la morfologia neuronale, la plasticità sinaptica, la sopravvivenza e le comunicazioni gliali. Ad oggi, numerosi studi hanno riportato che i difetti di questi sistemi causano varie malattie neuronali. Quindi, la comprensione dei meccanismi sottostanti alla dinamica delle vescicole può fornire indizi influenti che potrebbero aiutare nel trattamento di diversi disturbi neuronali. Qui descriviamo un metodo per quantificare le motilità delle vescicole, come la distanza della motilità e il tasso di movimento, utilizzando un plug-in software per la piattaforma ImageJ. Per ottenere immagini per la quantificazione, abbiamo etichettato strutture endosomi-lisosomi neuronali con proteine ​​del marker di vescicola tagged EGFP e osservato il movimento delle vescicole usando una microscopia a tempo trascorso. Questo metodo è estremamente utile e semplifica la misurazione della motilità della vescicola nei neuriti, come assoni e dendriti, così come nel soma di entrambi i neuroni e le cellule gliali. FurthermoQuesto metodo può essere applicato ad altre linee cellulari, come i fibroblasti e le cellule endoteliali. Questo approccio potrebbe fornire un prezioso avanzamento della nostra comprensione del traffico di membrana.

Questo test è stato progettato per misurare la dinamica delle vescicole nella coltura in vitro . Questo saggio è stato utilizzato per determinare la motilità vescicola associata alla morfologia neuronale e alla sopravvivenza. Figura 1A e B mostrano dati rappresentativi che mostrano la motilità dei lisosomi nei neuroni. I neuroni corticali sono stati trasfettati con il marker lizosomico, LAMP-EGFP, e osservati utilizzando un microscopio stand...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

L&#39;indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.

Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati ​​utilizzando sonde fluorescenti

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