Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00
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Agradecemos ao Dr. Ricardo Dolmetsch (Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford, afiliação atual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ajudar a desenvolver essa análise e ao Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara e Dongsook Kim por sua leitura crítica do manuscrito.

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Tsukuba (IACUC). 1. Dissecção <ol><li> Para preparar os fetos embrionários do dia 13-14 ICR ou C57BL / 6, eutanásia camundongos grávidas por deslocamento cervical. Remova o útero e coloque-o em uma placa de Petri com Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Enxaguar bem para remover o sangue. </li><li> Usando fórceps, transferir o útero para uma nova pla...

<ol>
	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+FIG4+causes+neurodegeneration+in+the+pale+tremor+mouse+and+patients+with+CMT4J.">Mutation of FIG4 causes neurodegeneration in the pale tremor mouse and patients with CMT4J.</a> Nature. 448 (7149), 68-72 (2007).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Vac14,+a+regulator+of+the+signaling+lipid+phosphatidylinositol+3,5-bisphosphate,+results+in+neurodegeneration+in+mice.">Loss of Vac14, a regulator of the signaling lipid phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate, results in neurodegeneration in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17518-17523 (2007).</li><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).</li><li>. Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Este protocolo introduz o procedimento para quantificar a motilidade vesicular. Nos neurônios primários, os endossomos e os lisossomos tendem a apresentar alta motilidade em neurônios mais jovens (4-6 DIV). Dado que os neurônios devem fornecer alguns componentes para os bordos de ataque para alongar os processos neurais, o tráfico de membranas deve ocorrer dinamicamente durante esta fase. Assim, é importante usar neurônios mais jovens para observar a motilidade dinâmica em dendritos neuronais. Além disso, vesí...

O controle preciso do tráfico de endossomas-lisossomos é indispensável para a regulação da função neuronal. Notavelmente, os movimentos dinâmicos destas vesículas são um factor chave subjacente à regulação da morfologia neuronal, desenvolvimento e sobrevivência. Defeitos neste sistema causam graves distúrbios neuronais 1 , 2 . Os mecanismos moleculares que ligam o tráfico de vesículas a doenças neuronais são considerados complicados, e vários grupos têm procurado examinar essa relevância. Por exemplo, foi relatado que a motilidade endosómica tardia perturbada está significativamente associada com a doença 3 de Niemann-Pick C, uma doença neurodegenerativa hereditária causada por defeitos de lisossoma. Outro exemplo é uma mutação num canal de Ca 2+ lisossómico , trpml 1, que prejudica a motilidade lisossómica, resultando em doenças de armazenamento lisossomal 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Nosso grupo relatou que a desregulação do PtdIns (3,5) P 2 volume de negócios suprime endosome e motilidade lisossomo nos neurônios, levando a um aumento da vulnerabilidade à resposta ao estresse 7 , 8 . A regulação metabólica de PtdIns (3,5) P 2 , que localiza principalmente os endossomas e os lisossomas tardios, desempenha um papel importante em uma ampla variedade de funções celulares, incluindo o tráfico de vesículas e os processos de fusão-fissão 9,10. Uma vez que o PtdIns (3,5) P 2 alterado provoca neurodegeneração grave 11,12, a regulação aberrante da motilidade endosoma-lisossoma pode ser um fator chave para a compreensão da patogênese da neurodegeneração. Uma investigação dos mecanismos moleculares subjacentes à motilidade vesicular pode assim fornecer pistas promissoras que podem aprofundar a nossaVários distúrbios neuronais. Neste artigo, introduzimos um valioso método para quantificar a motilidade vesicular em neurônios usando um pacote de software livre chamado Manual Tracking. O objetivo foi desenvolver um método de quantificação rápida para analisar a motilidade vesicular. Esta quantificação é dirigida através de uma abordagem padrão de clicar em um ponto de referência em cada quadro de um filme de lapso de tempo. O uso do software de rastreamento manual torna essa abordagem bastante simples e de ampla utilidade, ao contrário de outras aplicações. Além disso, esta abordagem é também aplicável a outras células, tais como células gliais. Embora este método seja primitivo, pode ser aplicado a várias análises, incluindo a motilidade celular ea alteração morfológica. Por exemplo, depois de definir um ponto de referência em uma seqüência de imagens, informações sobre as posições dos pontos de referência eo tempo em cada posição podem ser extraídos de imagens seqüenciais usando a análise de dados e softwares de processamento de imagenslouça. Tomados em conjunto, este método é simples, mas poderoso e contribui para o desenvolvimento de maior eficiência em estudos baseados no tráfico de membranas, como aqueles que examinam a função do endossoma-lisossoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptmycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine &#34;Max&#34;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24765</td>
			<td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOREVO BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation system INUG2-K13</td>
			<td>Tokay Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel version 15</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ verion 1.47</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

No cérebro, os sistemas de tráfico de membrana desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais, como morfologia neuronal, plasticidade sináptica, sobrevivência e comunicações gliais. Até à data, numerosos estudos têm relatado que defeitos nestes sistemas causam várias doenças neuronais. Assim, a compreensão dos mecanismos subjacentes à dinâmica das vesículas pode fornecer pistas influentes que poderiam auxiliar no tratamento de vários distúrbios neuronais. Aqui, descrevemos um método para quantificar motilidades de vesículas, tais como a distância de motilidade e a velocidade de movimento, utilizando um plug-in de software para a plataforma ImageJ. Para obter imagens para quantificação, marcamos estruturas de endossomas neuronais-lisossomas com proteínas marcadoras de vesículas marcadas com EGFP e observamos o movimento de vesículas usando uma microscopia de lapso de tempo. Este método é altamente útil e simplifica a medição da motilidade vesicular em neurites, tais como axônios e dendritos, bem como no soma de ambos os neurônios e células gliais. MaismoRe, este mï¿½odo pode ser aplicado a outras linhas celulares, tais como fibroblastos e cï¿½ulas endoteliais. Esta abordagem poderia fornecer um avanço valioso da nossa compreensão do tráfico de membrana.

Este ensaio foi concebido para medir a dinâmica das vesículas em culturas in vitro . Este ensaio foi utilizado para determinar a motilidade vesicular associada com morfologia neuronal e sobrevivência. As Figuras 1A e B apresentam dados representativos que mostram a motilidade dos lisossomas nos neurónios. Os neurï¿½ios corticos foram transfectados com o marcador de lisossoma, LAMP-EGFP, e observados utilizando um microscï¿½io ...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

A investigação do tráfico de membranas é crucial para a compreensão das funções neuronais. Aqui, introduzimos um método para quantificar a motilidade vesicular nos neurónios. Este é um método conveniente que pode ser adaptado para a quantificação do tráfico de membrana no sistema nervoso.

Quantificação de Endosome e Moosidades de Lisosoma em Neurônios Cultivados Usando Sondas Fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...