Name: quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes
Uploaded: 2017-05-22T13:00:00
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Agradecemos al Dr. Ricardo Dolmetsch (Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, afiliación actual: Novartis Institutes for Biomedical Research) por ayudar a desarrollar este análisis y al Dr. Matthew Wood, Takuma Aihara y Dongsook Kim por su lectura crítica del manuscrito.

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Tsukuba (IACUC). 1. Disección <ol><li> Para preparar fetos embrionarios del día 13-14 ICR o C57BL / 6, eutanasia ratones embarazadas por dislocación cervical. Retire el útero y póngalo en una placa de Petri con la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS). Enjuague bien para eliminar la sangre. </li><li> Usando fórceps, transfiera el útero a una nuev...

<ol>
	<li>Nicot, A. S., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+phosphoinositides+and+human+diseases.">Endosomal phosphoinositides and human diseases.</a> Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mendelian+disorders+of+membrane+trafficking.">Mendelian disorders of membrane trafficking.</a> N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+endosome+motility+depends+on+lipids+via+the+small+GTPase+Rab7.">Late endosome motility depends on lipids via the small GTPase Rab7.</a> EMBO J. 21 (6), 1289-1300 (2002).</li><li>Chen, C. S., Bach, G., Pagano, R. 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Manual Tracking, a plug-in for ImageJ software [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> (2017)</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exopolysaccharide-independent+social+motility+of+Myxococcus+xanthus.">Exopolysaccharide-independent social motility of Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 6 (1), e16102 (2011).</li><li>Tan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+four+type+IV+pilin+homologues+in+Stigmatella+aurantiaca+DSM17044+by+heterologous+expression+in+Myxococcus+xanthus.">Characterization of four type IV pilin homologues in Stigmatella aurantiaca DSM17044 by heterologous expression in Myxococcus xanthus.</a> PLoS One. 8 (9), e75105 (2013).</li><li>Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+cortactin+linked+to+acute+lung+injury+impairs+lamellipodia+dynamics+and+endothelial+wound+healing.">A genetic variant of cortactin linked to acute lung injury impairs lamellipodia dynamics and endothelial wound healing.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (9), L983-L994 (2015).</li><li>Dahirel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+propensity+and+ability+correlate+with+ecological+specialization+in+European+land+snails:+comparative+analysis+of+a+dispersal+syndrome.">Movement propensity and ability correlate with ecological specialization in European land snails: comparative analysis of a dispersal syndrome.</a> J Anim Ecol. 84 (1), 228-238 (2015).</li><li>Hu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+type+IV+pili+activity+and+exopolysaccharides+secretion+controls+motility+patterns+in+single+cells+of+Myxococcus+xanthus.">Interplay between type IV pili activity and exopolysaccharides secretion controls motility patterns in single cells of Myxococcus xanthus.</a> Sci Rep. 6, 17790 (2016).</li><li>. Manual Tracking [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual</a> (2017)</li><li>. ImageJ Tracking plug-in [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Category:Tracking">https://imagej.net/Category:Tracking</a> (2017)</li><li>Tinevez, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. , (2016).</li><li>Ekvall, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+small+aquatic+organisms+using+fluorescent+nanoparticles.">Three-dimensional tracking of small aquatic organisms using fluorescent nanoparticles.</a> PLoS One. 8 (11), e78498 (2013).</li><li>Jeyakumar, M., Dwek, R. A., Butters, T. D., Platt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Storage+solutions:+treating+lysosomal+disorders+of+the+brain.">Storage solutions: treating lysosomal disorders of the brain.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 713-725 (2005).</li></ol>

Este protocolo introduce el procedimiento para cuantificar la motilidad vesicular. En las neuronas primarias, los endosomas y los lisosomas tienden a mostrar una alta motilidad en las neuronas más jóvenes (4-6 DIV). Dado que las neuronas deben entregar algunos componentes a los bordes delanteros a los procesos neurales alargados, el tráfico de la membrana debe ocurrir dinámicamente durante esta etapa. Por lo tanto, es importante utilizar las neuronas más jóvenes para observar la motilidad dinámica en las dendrita...

El control preciso del tráfico de endosomas y lisosomas es indispensable para regular la función neuronal. En particular, los movimientos dinámicos de estas vesículas son un factor clave que subyace a la regulación de la morfología neuronal, el desarrollo y la supervivencia. Los defectos en este sistema causan trastornos neuronales graves 1 , 2 . Los mecanismos moleculares que vinculan el tráfico de vesículas a las enfermedades neuronales se consideran complicados, y varios grupos han tratado de examinar esta relevancia. Por ejemplo, se ha informado de que la motilidad endosómica tardía perturbada está significativamente asociada con la enfermedad de Niemann-Pick C 3 , un trastorno neurodegenerativo hereditario causado por defectos de lisosomas. Otro ejemplo es una mutación en un canal de Ca 2+ lisosomal , trpml 1, que altera la motilidad lisosomal, dando como resultado enfermedades de almacenamiento lisosomal 4 , 5 , </Sup&gt; 6 . Nuestro grupo ha informado de que la desregulación de PtdIns (3,5) P 2 volumen de negocios suprime endosoma y lisosoma motilidad en las neuronas, lo que conduce a un aumento de la vulnerabilidad a la respuesta al estrés 7 , 8 . La regulación metabólica de PtdIns (3,5) P 2 , que en su mayoría se localiza en endosomas tardíos y lisosomas, juega un papel importante en una amplia variedad de funciones celulares, incluyendo el tráfico de vesículas y los procesos de fusión-fisión 9,10. Dado que el deterioro de PtdIns (3,5) P 2 volumen de negocios causa neurodegeneración grave 11 , 12 , la regulación aberrante de la motilidad endosoma-lisosoma podría ser un factor clave para la comprensión de la patogénesis de la neurodegeneración. Una investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la motilidad vesicular puede proporcionar pistas prometedoras que pueden profundizar nuestroDe varios trastornos neuronales. En este artículo, introducimos un valioso método para cuantificar la motilidad de las vesículas en las neuronas utilizando un paquete de software gratuito llamado Manual Tracking. El objetivo fue desarrollar un método de cuantificación rápida para analizar la motilidad vesicular. Esta cuantificación se dirige a través de un enfoque estándar de hacer clic en un punto de referencia en cada fotograma de una película de tiempo transcurrido. El uso del software de seguimiento manual hace este enfoque bastante simple y de amplia utilidad, a diferencia de otras aplicaciones. Además, este enfoque es también aplicable a otras células, como las células gliales. Aunque este método es primitivo, puede aplicarse a diversos análisis, incluyendo la motilidad celular y el cambio morfológico. Por ejemplo, después de definir un punto de referencia a través de una secuencia de imágenes, la información sobre las posiciones de los puntos de referencia y el tiempo en cada posición se pueden extraer de imágenes secuenciales utilizando análisis de datos y procesamiento de imagen suavemercancía. En conjunto, este método es simple pero potente y contribuye al desarrollo de una mayor eficiencia en los estudios basados ​​en el tráfico de membranas, como los que examinan la función del endosoma-lisosoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium&#160;</td>
			<td>Wako</td>
			<td>044-29765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985070</td>
			<td>Serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin Streptmycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplements</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Trypsine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-ornithine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine &#34;Max&#34;</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24765</td>
			<td>Transfection reagent. As an alternative to Lipofectamine2000, 0.1mg/ml Polyethyleneimine dissolved in sterilized water is available. But it is low efficiency and high toxicity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOREVO BZ-9000</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation system INUG2-K13</td>
			<td>Tokay Hit</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 6.0</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel version 15</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ verion 1.47</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of endosome and lysosome motilities in cultured neurons using fluorescent probes

En el cerebro, los sistemas de tráfico de membrana desempeñan un papel importante en la regulación de las funciones neuronales, como la morfología neuronal, la plasticidad sináptica, la supervivencia y las comunicaciones gliales. Hasta la fecha, numerosos estudios han informado de que los defectos en estos sistemas causan diversas enfermedades neuronales. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos subyacentes dinámica de las vesículas puede proporcionar influyentes pistas que podrían ayudar en el tratamiento de varios trastornos neuronales. Aquí, describimos un método para cuantificar las motilidades vesicales, tales como la distancia de motilidad y la velocidad de movimiento, utilizando un plug-in de software para la plataforma ImageJ. Para obtener imágenes para la cuantificación, que etiquetados neuronal endosoma-lisosoma estructuras con EGFP marcado vesícula marcador proteínas y observó el movimiento de vesículas utilizando un lapso de tiempo microscopía. Este método es muy útil y simplifica la medición de la motilidad vesicular en las neuritas, tales como axones y dendritas, así como en el soma de ambas neuronas y células gliales. Más alláRe, este método puede aplicarse a otras líneas celulares, tales como fibroblastos y células endoteliales. Este enfoque podría proporcionar un valioso avance en nuestra comprensión del tráfico de membranas.

Este ensayo fue diseñado para medir la dinámica vesicular en cultivo in vitro . Este ensayo se utilizó para determinar la motilidad vesicular asociada con morfología neuronal y supervivencia. Las Figuras 1A y B muestran datos representativos que muestran la motilidad de los lisosomas en las neuronas. Las neuronas corticales se transfectaron con el marcador de lisosoma, LAMP-EGFP, y se observaron usando un microscopio de fluorescenci...

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Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

La investigación del tráfico de membranas es crucial para entender las funciones neuronales. Aquí, se introduce un método para la cuantificación de la motilidad vesicular en las neuronas. Este es un método conveniente que puede adaptarse a la cuantificación del tráfico de membranas en el sistema nervioso.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A gran escala de grabación de las neuronas por medio de sondas de silicio móviles en comportarse roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

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Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

Estudio genético de la regeneración axonal en neuronas cultivadas de Adultos ganglio de la raíz dorsal

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

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La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

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