Name: in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

وأيد هذا العمل من قبل DECRA ARC إلى PRJ (DE120101311) ومنحة بحثية الألمانية للبحوث (DFG) ليرة لبنانية (أ ف ب 1440 / 1-1). ويدعم معهد الطب التجديدي الاسترالي بأموال من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الاتحادية الاسترالية. ونحن نعترف الدكتور جيريمي نغ تشي كى، الذي أجرى تجارب الموصوفة هنا كما نشرت في كى آخرون. ، عام 2016. ونحن ممتنون لأحكام الأسماك المعدلة وراثيا من البروفيسور Higashijima وأشكر الأستاذان. تيرنر وروب لتوفير pCS2 + البلازميد والدكتور ويلكنسون لتوليد H2B-طلب تقديم العروض وH2A-GFP يبني. نشكر موظفي منشأة FishCore (جامعة موناش) لرعاية الحيوانات لدينا.

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لأحكام مجلس البحوث الطبية الصحية الوطنية ورمز الاسترالية لممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجان الأخلاقيات المؤسسية. 1. إعداد الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;directi...

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish:+EMBO+practical+course,+KIT,+Sept.+2013.">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23 (2013).</li><li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+in+the+vertebrate+retina.">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li><li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation.">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2.">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina.">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos.">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina.">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vsx2+in+the+zebrafish+retina:+restricted+lineages+through+derepression.">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14 (2009).</li><li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina.">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li><li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina.">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li><li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2 (2006).</li><li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alx,+a+zebrafish+homolog+of+Chx10,+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits.">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li><li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord.">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing.">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos.">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish.">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898 (2014).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas.">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li><li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish,+Fundulus+heteroclitus.">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li><li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenesis+in+the+monkey+retina.">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li><li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina.">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li><li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+goldfish+retina.">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li><li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina.">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li></ol>

فهم إلى أي مدى الخلايا المجاورة تؤثر توقيت التعبير عن العوامل التي تحدد مصير خلية حاسم من الضروري عندما تهدف إلى إرشاد كفاءة الخلايا الجذعية الجنينية متعدد القدرات أو حمله على التمايز إلى نوع خلية معينة في مرحلة ما بعد الإنقسامية أو حتى الأنسجة المزخرفة. وعلاوة على ?...

<html> وقد ساهم القدرة على تصور العمليات التنموية الهامة في الفقاريات في الجسم الحي لجعل الزرد نموذجا أساسيا لدراسة الظروف العادية والمرض (إعادة النظر في 1 و 2). على وجه الخصوص، الشبكية العصبية هي جزء لا يمكن الوصول إليها من الجهاز العصبي المركزي. شبكية العين يفسح المجال لسهولة إجراء دراسات من الخلايا العصبية بسبب، بعد بنية بسيطة نسبيا درجة عالية من التنظيم لها، وأنواع الخلايا العصبية الحفظ جدا في جميع أنحاء نوعا من الفقاريات 3. يمكن اتباعها ديناميات السلوكيات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية، خروج دورة الخلية، انقسام الخلايا غير المتماثلة، مواصفات مصير، والتمايز، وتشكيل الدوائر العصبية في جميع أنحاء العملية برمتها من retinogenesis، التي أنجزت في الشبكية المركزية للالزرد بنسبة 3 د postfertilization ( DPF) 4، 5،المرجع &quot;&gt; 6 و 7. وعلاوة على ذلك، فإن المتطلبات الوظيفية من الجينات المختلفة في كل مرحلة من المراحل المذكورة أعلاه يمكن تقييم متزامنة في شبكية العين الزرد، وتوفير ميزة على نماذج الفقاريات الأخرى التي الظواهر الناتجة عن تطبيق تقنيات خروج المغلوب الجينات يمكن تقييمها إلا بعد تشريح الجثة الثابتة الأنسجة. على وجه الخصوص، واستخدام خطوط المعدلة وراثيا التي يمكننا تصور ورصد التعبير من البروتينات الفلورية كما الجينات المحورة مراسل في شبكية العين، ويسمح لنا للحصول على قرار الزمني في التعبير الجيني الذي يكمن وراء نشأة معين نوع من الخلايا العصبية. نظرا للتطور السريع في الزرد، ويمكن تصور هذه الأحداث خلال الفترة التنموية برمتها، وبالتالي توفير رؤية أعمق في أهمية الزمانية في التعبير الجيني فيما يتعلق اكتساب هوية الخلايا العصبية وسلوك الخلية. وأخيرا، هذه الأساليب يمكن الجمع بين الكفاءة في الزرد مع جيل من الوهم عن طريق زرع، مما أدى إلى نظرة ثاقبة جانبين رئيسيين من وظيفة الجين. أولا، ودراسة الخلايا المزروعة من جنين المانحة، الذي كان يطرق على جين معين أسفل في حين أنها تتطور في بيئة نوع البرية غير المسماة، ويسمح لنا للحصول على المعلومات ذات الصلة حول وظيفة الجين بطريقة خلية مستقلة. وهذا يؤدي إلى معلومات هامة عن وظيفة العوامل مصير المحدد الشبكية داخل الخلايا الاولية يعبر عنها عادة. وهذا ما يتضح من فحص نتائج مصير التنموية من الأسلاف التي لم تعد قادرة على توليد البروتين وظيفية من هذه الجينات 4، 6، 8، 9. باستخدام هذا النهج، ونحن قد أظهرت أن العوامل المحددة العديد من مصير (على سبيل المثال، Vsx1، Atoh7، Ptf1a، Barhl2) تعمل خلية-autonomously لدفع مصير الخلايا العصبية للشبكية محددة؛ عدم التعبير الجيني يؤدي في المقام الأول إلى تبديل القدر، بحيث الخلايا مع الجينات ضربة قاضية لا تزال قابلة للحياة من خلال تبني خلية مصير بديل 4، 6، 7، 10. ثانيا، مثل هذه التجارب خيالية يمكن استخدامها لتقييم مدى البرية تتصرف نوع الأسلاف عندما تعمل على تطوير ضمن بيئات وراثية مختلفة. على سبيل المثال، عن طريق مقارنة تطوير خلايا WT التي عادة ما تعبر عن الجين (والتحوير مراسل) في WT مقابل البيئة المضيفة التلاعب (على سبيل المثال، بالضربة القاضية جين / ضربة قاضية)، والآثار الناجمة على التعبير الجيني ومصير خلية يمكن تقييم . عدم وجود أنواع معينة من الخلايا العصبية في بيئة المضيف، على سبيل المثال، فقد تبين للتأثير على سلوك السلف النوع البري في خلية بطريقة غير المتمتعة بالحكم الذاتي، إلى التحيز لهم نحو التفريق في س ممثلة تمثيلا ناقصاص المفقودين أنواع الخلايا العصبية 4، 7، 11، 12. وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية للشبكية ولدت في ترتيب histogenic يصونها بالتتابع التعبير توقيت الجينات مصير المحدد العصبية محددة (التعبير الجيني مصير) (إعادة النظر في 13)، استخدمنا هذه الطرق لشرح كيفية وتوقيت التعبير مصير الجيني في الأسلاف نوع البرية يتأثر عندما تتطور هذه الأسلاف في البيئات الشبكية المضيفة مع التراكيب الخلوية الشاذة التي يسببها. هنا، ونحن الخطوط العريضة لهذه النهج كدليل لكيفية الجمع بين تقنيات قياسية نسبيا، وتستخدم على نطاق واسع يمكن النظر في توقيت التعبير الجيني مصير في تطوير الأسلاف شبكية العين 8 و 9. يصف هذا البروتوكول نهج تجريبي يجمع الوقت الفاصل بين التصوير مع سهولة فيتشكيل زرع في الجسم الحي السابقين تطوير الجنين الزرد لمتابعة mosaically الفردية الخلايا المسمى طوال فترة من retinogenesis التنموية. عن طريق أداء التلاعب الجيني وظيفية سواء في الجنين المضيف، الجنين المانحة، على حد سواء أو لا، يمكن للمرء أن تقييم الحكم الذاتي خلية من وظيفة الجين. ويمكن تكييف هذا النهج على نطاق واسع على أسئلة بحوث مماثلة في أي نظام آخر والتي المكونات الفردية المذكورة هنا هي مناسبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low melt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td>Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube w/o filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0035</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube with filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dishes (60 mm diameter)</td>
			<td>Science Supply</td>
			<td>1070506</td>
			<td>any glass alternative of any size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection tube (2m)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>524616004</td>
			<td>This connects the needle holder to the syringe during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>alternatives with similar shape can be use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microneedle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjector</td>
			<td>Narishige or Eppendorf Femtojet</td>
			<td></td>
			<td>Pneumatic injector using gas pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td>M330IR</td>
			<td>similar alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>PM996</td>
			<td>any paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette plastic</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Hirschmann Laborgeraete</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5942-25MG</td>
			<td>&#160;Protease Type XIV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenyl thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick gel extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>any alternatives to purify DNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>any alternatives to purify RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>any alternatives to transcribe DNA using SP6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences

جعلت القوة الوراثية والتقنية الفقاريات الزرد نموذج كائن أساسي في أي عواقب التلاعب الجيني يمكن أن تعزى في الجسم الحي خلال الفترة الإنمائية السريعة. عمليات متعددة يمكن دراستها بما في ذلك تكاثر الخلايا، التعبير الجيني، هجرة الخلايا والتشكل. والأهم من ذلك الجيل من الوهم من خلال زرع يمكن أداؤها بسهولة، مما يتيح وضع العلامات الفسيفساء وتتبع الخلايا الفردية تحت تأثير البيئة المضيفة. على سبيل المثال، من خلال الجمع بين التلاعب وظيفية جينات الجنين المضيف (على سبيل المثال، من خلال حقن مكروي morpholino) والتصوير الحي، وآثار خارجي، إشارات الخلية nonautonomous (التي تقدمها البيئة المعدلة وراثيا) على الخلايا المانحة زرع الفردية يمكن تقييمها. نحن هنا لشرح كيفية استخدام هذا النهج لمقارنة بداية من التعبير التحوير الفلورسنت كوكيل لتوقيت determin مصير الخليةأوجه في مختلف البيئات المضيف الجيني. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكول للmicroinjecting الأجنة الزرد بمناسبة الخلايا المانحة، ويسبب ضربة قاضية الجينات في الأجنة المضيفة، وصفا للتقنية زرع استخدامها لتوليد أجنة خيالية، وبروتوكول لإعداد وتشغيل في الجسم الحي متحد البؤر الوقت الفاصل تصوير الأجنة المتعددة. على وجه الخصوص، وأداء التصوير العديد من المواقع من الأهمية بمكان عند المقارنة بين توقيت الأحداث مثل ظهور التعبير الجيني. وهذا يتطلب جمع البيانات من السيطرة متعددة والأجنة التجريبية معالجتها في وقت واحد. يمكن بسهولة أن يمتد هذا النهج للدراسات التأثيرات خارجي في أي عضو أو نسيج من خيار للوصول للعيش التصوير، شريطة أن زرع يمكن استهداف بسهولة وفقا لخرائط مصير الجنينية المعمول بها.

يعرض هذا العمل بروتوكول تجريبي لتقييم التغيرات في التعبير الجيني توقيت عندما تتطور النوع البري الأسلاف الشبكية داخل الجنين المضيف morphant. الأجنة المضيفة التجريبية هي morphants Ptf1a، التي تفتقر إلى interneurons المتوسطة ولد الأفقي وعديم الاستطالات الشبكية <sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

تتبع الحية الفردية الأسلاف شبكية العين WT في خلفيات وراثية متميزة يسمح لتقييم مساهمة الخلية إشارات غير المتمتعة بالحكم الذاتي خلال تكوين الخلايا العصبية. هنا، واستخدمت مجموعة من إسقاط الموروثة، وتوليد الوهم عن طريق زرع الجنين وفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر لهذا الغرض.

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

تتبع الخلايا في الزرد-GFP المعدلة وراثيا باستخدام نظام Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

تحليل<em&gt; في فيفو</em&gt; الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...