Name: in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

עבודה זו נתמכה על ידי ARC DECRA כדי PRJ (DE120101311) ועל ידי (DFG) מענק מחקר כדי LP (PO 1440 / 1-1). המכון לרפואה רגנרטיבית האוסטרלי נתמכת על ידי קרנות מממשלת מדינת ויקטוריה הממשלה הפדרלית האוסטרלית. אנו מכירים ד&quot;ר ג&#39;רמי נג צ&#39;י Kei, שניהל הניסויים שתוארו כאן כפי שפורסם Kei et al. 2016. אנו מודים על הוראות דג מהונדס מפרופ Higashijima ותודה פרופ. טרנר רופ למתן של pCS2 + פלסמיד וד&quot;ר וילקינסון להפקת בונה H2B-RFP ו H2A-GFP. אנו מודים צוות המתקן FishCore (אוניברסיטת מונאש) עבור מטפלת החיות שלנו.

כל הנהלים בוצעו על פי הוראות הקוד המועצה למחקר רפואי ובריאות הלאומית של אוסטרליה עיסוק לטיפול ולשימוש בחיות ואת אושרו על ידי ועדות האתיקה של המוסד הרפואי. 1. הכנת דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיווג דג...

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish:+EMBO+practical+course,+KIT,+Sept.+2013.">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23 (2013).</li><li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+in+the+vertebrate+retina.">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li><li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation.">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2.">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina.">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos.">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina.">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vsx2+in+the+zebrafish+retina:+restricted+lineages+through+derepression.">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14 (2009).</li><li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina.">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li><li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina.">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li><li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2 (2006).</li><li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alx,+a+zebrafish+homolog+of+Chx10,+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits.">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li><li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord.">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing.">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos.">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish.">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898 (2014).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas.">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li><li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish,+Fundulus+heteroclitus.">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li><li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenesis+in+the+monkey+retina.">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li><li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina.">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li><li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+goldfish+retina.">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li><li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina.">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li></ol>

הבנתי את המידה שבה תאי שכנים להשפיע עיתוי של הביטוי של גורמים בקביעת גורל תא חיוני חיוני כאשר מכוונים להורות עוברי או מושרה ביעילות תאי גזע מולטיפוטנטיים להתמיין לסוג תא ספציפי שלאחר mitotic או אפילו רקמה בדוגמת. יתר על כן, בחינת האירועים המולקולריים האלה בתאים המתפתחי?...

<html> היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב 1, 2). בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות 3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזברה על ידי 3 ד postfertilization ( 4 DPF), 5,נ&quot;צ &quot;&gt; 6, 7. יתר על כן, הדרישות הפונקציונליות של גנים שונים בכל השלבים שהוזכרו לעיל ניתן להעריך בו זמנית ברשתית דג הזברה, מתן יתרון על פני דגמים חוליות אחרים בהם פנוטיפים וכתוצאה מיישום של טכניקות נוקאאוט גנטי ניתן להעריך רק בבדיקה שלאחר המוות של קבוע רקמות. בפרט, השימוש בקווים מהונדסים שבו אנו יכולים לחזות את ולנטר את הביטוי של חלבוני ניאון כמו transgenes כתב ברשתית, מאפשר לנו להשיג החלטה זמנית של ביטוי גנים העומדים בבסיס ראשיתו של סוג תאים עצבי בפרט. בשל ההתפתחות המהירה של דג זברה, אירועים אלה ניתן דמיינו בתקופה התפתחותית כולו, ובכך לספק תובנה עמוקות יותר את החשיבות הזמנית של ביטוי גנים ביחס לרכישת זהות תאים עצבית ועל התנהגות תא. לבסוף, גישות אלה ניתן לשלב ביעילות של דג הזברה עם הדור של הכימרה באמצעות השתלות, וכתוצאה מכך תובנות שני היבטים מרכזיים של תפקוד הגן. ראשית, בחינת תאים המושתלים מעובר תורם, שבו גן מסוים ופל תוך שהם מפתחים בסביבת סוג ברה ללא תווית, מאפשר לנו להשיג מידע רלוונטי על תפקוד גן באופן תא אוטונומי. זה מוביל לתובנות חשובות לגבי הפונקציה של גורמים הקובע גורל רשתית בתוך ובתאים הם באים לידי ביטוי בדרך כלל. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינה של התוצאה גורל התפתחותי של אבות כי כבר לא יכול ליצור חלבון פונקציונלי מן הגנים האלה 4, 6, 8, 9. ניצול גישה זו, הראינו כי גורמים הקובעים גורל רב (למשל, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) לפעול תא-autonomously לנהוג גורלות עצביים ברשתית ספציפית; חוסר ביטוי גנים מוביל בעיקר למתג גורל, כך התאים עם גן המציאה להישאר קיימא על ידי אימוץ גורל 4 תאים חלופי, 6, 7, 10. שנית, ניסויי כימרי כזה יכול לשמש כדי להעריך כמה פרא סוג אבות להתנהג כאשר הם מפתחים בתוך סביבות גנטיות שונות. לדוגמא, על ידי השוואת התפתחות תאי WT שבדרך כלל לבטא את גן של עניין (ו transgene כתב) בתוך WT לעומת סביבת מארח מניפולציות (למשל, נוקאאוט גנטי / מציאה), את ההשפעות הנובעות על ביטוי גני גורל תא ניתן להעריך . חוסר סוגי נוירונים מסוימים בסביבת המארחת, למשל, מוכיח להשפיע על התנהגות אב סוג בר באופן תאים שאינם אוטונומי, להטות אותם לכיוון הבחנה לתוך o מיוצגת כראויr חסר סוגי נוירונים 4, 7, 11, 12. בהתחשב בכך נוירונים ברשתית נולדים צו histogenic נשמר על ידי ביטוי מתוזמן ברצף של גנים הקובעים גורל ספציפיים עצביים (ביטוי גני גורל) (הנסקרת ב 13), השתמשנו בשיטות אלה כדי להדגים כיצד התזמון של ביטוי גני גורל אבות סוג ברים מושפע כאשר אבות כאלה לפתח בסביבות מארח רשתית עם קומפוזיציות הסלולר סוטות מושרות. כאן, אנו מתארים גישות אלה כעדות איך השילוב לסטנדרטים יחסית בשימוש נרחב בטכניקות מאפשר בחינת המועדים של ביטוי גני גורל בפיתוח אבות רשתית 8, 9. פרוטוקול זה מתאר גישה ניסויית שילוב הדמיה זמן לשגות עם הקלות של לכללהרכיב השתלת בעובר דג הזברה פיתוח vivo לשעבר כדי לעקוב אחר תאים בודדים mosaically שכותרתו לאורך כל תקופת retinogenesis התפתחותית. על ידי ביצוע מניפולציות גן פונקציונלי או בעובר המארח, העובר התורם, שניהם או אף אחד, אפשר להעריך את האוטונומיה תאים של תפקוד הגן. גישה זו ניתן להתאים נרחבת לשאלות מחקר דומות בכל מערכת אחרת עבורו הרכיבים הבודדים המפורטים כאן מתאימים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low melt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td>Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube w/o filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0035</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube with filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dishes (60 mm diameter)</td>
			<td>Science Supply</td>
			<td>1070506</td>
			<td>any glass alternative of any size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection tube (2m)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>524616004</td>
			<td>This connects the needle holder to the syringe during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>alternatives with similar shape can be use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microneedle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjector</td>
			<td>Narishige or Eppendorf Femtojet</td>
			<td></td>
			<td>Pneumatic injector using gas pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td>M330IR</td>
			<td>similar alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>PM996</td>
			<td>any paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette plastic</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Hirschmann Laborgeraete</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5942-25MG</td>
			<td>&#160;Protease Type XIV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenyl thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick gel extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>any alternatives to purify DNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>any alternatives to purify RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>any alternatives to transcribe DNA using SP6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences

החוזק הגנטי וטכני הפכו את חוליות דג הזברה אורגניזם מודל מפתח אשר ההשלכות של מניפולציות הגן ניתן לייחס in vivo לאורך כל תקופת ההתפתחות המהירה. ניתן ללמוד מספר רב של תהליכים כולל התפשטות תאים, ביטוי גנים, נדידת תאים ומורפוגנזה. חשוב לציין, הדור של מפלצות באמצעות השתלות יכול להתבצע בקלות, ומאפשר תיוג פסיפס ומעקב של תאים בודדים תחת שפעת הסביבה המארחת. לדוגמא, על ידי שילוב של מניפולציות גן פונקציונליות של עובר המארח (למשל, באמצעות microinjection morpholino) ו הדמיה לחיות, את ההשפעות של חיצוני, אותות nonautonomous תא (המסופקים על ידי הסביבה המהונדסת הגנטי) על תאי תורם מושתלים בודדים ניתן להעריך. כאן אנו מדגימים כיצד גישה זו משמשת כדי להשוות את התחלתה של ביטוי transgene ניאון כמדד עיתוי determin גורל התאation בסביבות מארח גנטי שונה. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור microinjecting עוברי דג זברה כדי לסמן תאים תורמים לגרום מציאת גן בעוברים מארחים, תיאור של טכניקת ההשתלה השתמשה כדי ליצור עבר chimeric, ואת הפרוטוקול להכנה והפעלה בתוך confocal הזמן לשגות vivo הדמיה של עוברים מרובים. בפרט, ביצוע הדמיה multiposition הוא קריטי כאשר משווים עיתוי אירועים כגון התפרצות של ביטוי גנים. זה דורש איסוף נתונים מתוך שליטה מרובה ועובר ניסיוני מעובד בו זמנית. גישה כזו ניתן להרחיב בקלות ללימודים של השפעות חיצוניות בכל איבר או רקמה של בחירה נגישה לחיות הדמיה, ובלבד השתלות ניתן לכוון בקלות על פי מפות גורל עובריות הוקמו.

עבודה זו מציגה פרוטוקול ניסוי להעריך שינויים בעיתוי ביטוי גנים כאשר אבות רשתית סוג בר להתפתח בתוך עובר מארח morphant. עובר מארח ניסיוני הם morphants Ptf1a, אשר חסרים את interneurons האופקי amacrine ביניים הנולד של הרשתית 7, 26. אלה היו לעומת...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...