Name: in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

この作品は、PRJ（DE120101311）へとLP（PO 1440 / 1-1）にドイツ学術協会（DFG）研究助成金によってARC DECRAによってサポートされていました。オーストラリアの再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア連邦政府からの資金によってサポートされています。私たちは、圭らに公開され、ここで説明した実験を行った博士ジェレミー呉チー圭を、認めます。 、2016年には、我々は教授東島からトランスジェニック魚の規定に感謝していとPROFSに感謝します。 H2B-RFPとH2A-GFP構築物を生成するためのPCS2 +プラスミドと博士ウィルキンソンの提供のためにターナーとラップ。私たちは、動物の世話をするためのFishCore施設のスタッフ（モナッシュ大学）に感謝します。

すべての手順は、動物の管理と使用の実践のためのオーストラリア国立保健医療研究評議会コードの規定に従って行われたと制度倫理委員会によって承認されました。 ゼブラフィッシュの調製<ol><li>大人の魚のペアリング<ol><li>夕方には、使用前に適切なサイズの繁殖タンク内のペア（または2ペア）として成魚を設定します。 </li><li>男性から分離された女性を、維持す...

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish:+EMBO+practical+course,+KIT,+Sept.+2013.">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23 (2013).</li><li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+in+the+vertebrate+retina.">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li><li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation.">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2.">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina.">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos.">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina.">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vsx2+in+the+zebrafish+retina:+restricted+lineages+through+derepression.">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14 (2009).</li><li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina.">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li><li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina.">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li><li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2 (2006).</li><li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alx,+a+zebrafish+homolog+of+Chx10,+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits.">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li><li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord.">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing.">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos.">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish.">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898 (2014).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas.">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li><li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish,+Fundulus+heteroclitus.">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li><li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenesis+in+the+monkey+retina.">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li><li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina.">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li><li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+goldfish+retina.">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li><li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina.">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li></ol>

効率的に特定の有糸分裂後の細胞型、あるいはパターン化された組織に分化する胚性または誘導された多能性幹細胞を指示することを目指したときにエクステントがどの隣接セルが重要な細胞の運命決定因子の発現のタイミングに影響を与えるように理解することが不可欠です。また、生きている動物の開発細胞におけるこれらの分子事象を調べることに加えて、関連する動的な生体内で...

<html> in vivoでの脊椎動物における重要な発達過程を視覚化する能力は、ゼブラフィッシュ（1、2に概説されている）正常および疾患状態を研究するための重要なモデル作りに貢献してきました。特に、神経網膜は、中枢神経系のアクセス部分です。網膜は、その高度に組織化された、まだ比較的単純な構造、および脊椎動物種3渡ってその高度に保存された神経細胞の種類に簡単に神経新生の研究を行うために自分自身を貸します。 3次元postfertilizationによってゼブラフィッシュの網膜中心に完成され、増殖、細胞周期の出口、非対称細胞分裂、運命の仕様、分化、および神経回路の形成などの細胞の挙動のダイナミクスretinogenesisのプロセス全体を通して追跡することができます、（ DPF）4、5、REF &quot;&gt; 6、7。 また、上記の各段階における異なる遺伝子の機能要件は、同時にのみ死後検査時に評価することが可能な遺伝子ノックアウト技術の適用に起因する表現型を他の脊椎動物モデルに勝る利点を提供する、ゼブラフィッシュ網膜に評価することができます固定組織の。特に、我々は、網膜におけるレポーター導入遺伝子として蛍光タンパク質の発現を可視化し、監視することができるトランスジェニック株の使用は、我々は、特定の神経細胞型の発生の根底にある遺伝子発現の時間分解能を得ることができます。ゼブラフィッシュの急速な発展に、これらのイベントは、それによって神経細胞のアイデンティティの獲得と細胞挙動に関連する遺伝子発現の時間的な重要性をより深く洞察を提供し、全体の発達期間中に可視化することができます。 最後に、これらのアプローチは、遺伝子機能の二つの重要な側面への洞察が得られ、移植を介してキメラを生成するとゼブラフィッシュで効率的に組み合わせることができます。まず、彼らは非標識野生型環境で開発しながら、特定の遺伝子をノックダウンされたドナー胚から移植された細胞を、調べる、私たちは細胞自律的な方法で、遺伝子機能に関する関連情報を得ることができます。これは、それらが通常で表現された前駆細胞内の網膜の運命決定因子因子の機能に関する重要な洞察につながる。これはもはやこれらの遺伝子4、6から機能性タンパク質を生成することができる前駆細胞の発生運命の結果を検査することによって例示され、 8,9。このアプローチを利用して、我々は多くの運命決定因子の因子（ 例えば、Vsx1、Atoh7、Ptf1a、Barhl2）は、細胞を作用することが示されています-autonomously特定の網膜神経運命を駆動します。遺伝子発現の欠如は、主に遺伝子ノックダウンを有する細胞は、代替の細胞の運命4、6、7、10を採用することにより、生存し続けるように運命のスイッチをもたらします。第二に、このようなキメラ実験は、異なる遺伝的環境内で開発するときに型前駆細胞がどのように振る舞うか野生評価するために使用することができます。例えば、通常操作さホスト環境（ 例えば、遺伝子ノックアウト/ノックダウン）対WTに目的の遺伝子（レポーター導入遺伝子）を発現するWT細胞の発達を比較することによって、遺伝子発現および細胞運命のその影響を評価することができます。ホスト環境における特定のニューロン型の欠如は、例えば、細胞非自律的な方法で、野生型前駆体の挙動に影響を与えることが示されており、過小評価Oへの分化に向かってバイアスそれらにニューロンタイプ4、7、11、12が欠落して rを。網膜神経細胞は、特定の神経細胞の運命決定因子遺伝子の順次時限式（13に総説）（運命の遺伝子発現）によって保存された組織原のために生まれていることを考えると、我々は、野生型の前駆細胞における運命の遺伝子発現のどのタイミングを示すためにこれらのメソッドを使用しましたそのような前駆細胞が誘導される異常な細胞組成物と網膜のホスト環境で開発する際に影響を受けています。ここで、我々はどのように比較的標準と広く使われている技術の組み合わせは、網膜前駆細胞8、9の開発に運命の遺伝子発現のタイミングの検査を可能にします。ための証拠としてこれらのアプローチを概説しますこのプロトコルは、あたりの容易さとタイムラプスイメージングを組み合わせた実験的なアプローチについて説明します発達retinogenesisの全期間を通じて個々のモザイク状の標識細胞を追跡するためにゼブラフィッシュ胚の開発エクスビボでの移植を形成します。いずれかの宿主胚に機能的な遺伝子操作を行うことにより、ドナー胚、両方またはどちらも、一方は遺伝子機能の細胞自律性を評価することができます。このアプローチは、ここで説明し、個々の成分が適しているため、他のシステムにおける同様の研究課題に広く適応することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low melt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td>Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube w/o filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0035</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube with filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dishes (60 mm diameter)</td>
			<td>Science Supply</td>
			<td>1070506</td>
			<td>any glass alternative of any size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection tube (2m)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>524616004</td>
			<td>This connects the needle holder to the syringe during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>alternatives with similar shape can be use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microneedle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjector</td>
			<td>Narishige or Eppendorf Femtojet</td>
			<td></td>
			<td>Pneumatic injector using gas pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td>M330IR</td>
			<td>similar alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>PM996</td>
			<td>any paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette plastic</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Hirschmann Laborgeraete</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5942-25MG</td>
			<td>&#160;Protease Type XIV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenyl thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick gel extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>any alternatives to purify DNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>any alternatives to purify RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>any alternatives to transcribe DNA using SP6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences

遺伝的および技術的な強みは、遺伝子操作の結果は急速な発達期間を通じて生体内で追跡することができたゼブラフィッシュ脊椎動物鍵モデル生物を行いました。複数のプロセスは、細胞増殖、遺伝子発現、細胞遊走及び形態形成を含む、研究することができます。重要なことは、移植を介してキメラの生成を容易にホスト環境の影響下で個々の細胞のモザイク標識および追跡を可能にする、実行することができます。例えば、宿主胚の機能的な遺伝子操作組み合わせることによって（ 例えば、モルホリノマイクロインジェクションによって）ライブイメージング、外因性の影響は、個々の移植されたドナー細胞上の（遺伝的に改変された環境が提供された）細胞非自律信号を評価することができます。ここでは、このアプローチは、細胞の運命determinのタイミングのためのプロキシとして蛍光導入遺伝子発現の発症を比較するために使用される方法を示し異なる遺伝子ホスト環境でエーション。 この記事では、我々は、ドナー細胞をマークするために、ホスト胚における遺伝子ノックダウンを引き起こすためにゼブラフィッシュの胚をマイクロインジェクションのためにin vivoタイムラプス共焦点に準備し、実行するためのキメラ胚を生成するために使用される移植技術、およびプロトコルの説明をプロトコルを提供します複数の胚のイメージング。このような遺伝子発現の開始などのイベントのタイミングを比較した場合、特に、多位置イメージングを行うことが重要です。これは、複数の制御と同時に処理実験胚からのデータ収集が必要です。このようなアプローチは、簡単に選択した任意の器官または組織に外因性の影響の研究のためのイメージングを生きるためにアクセス可能な拡張することができ、移植が確立胚の運命マップに従って、容易に標的とすることができることを条件とします。

この作品は、野生型の網膜前駆細胞がモルファント宿主胚内で開発する場合、遺伝子の発現タイミングの変化を評価するための実験プロトコルを提示します。実験宿主胚は、網膜7、26の中間生まれ水平およびアマクリン介在ニューロンを欠いPtf1aのモルファント、です。これらは、標準の制御モルホリノを注射した宿主胚を...

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In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...