Name: in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences at JoVE.c

이 작품은 (PO 1440 / 1-1) LP하는 PRJ에 ARC DECRA (DE120101311)에 의해과 독일 연구 협회 (DFG)의 연구 보조금에 의해 지원되었다. 호주 재생 의학 연구소는 빅토리아 주 정부와 호주 연방 정부의 자금 지원됩니다. 우리는 케이 등의 알에 게시 여기에 기술 된 실험을 실시 박사 제레미 잉 치 케이를 인정합니다. 2016 년 우리는 교수 Higashijima에서 형질 전환 어류의 규정에 대한 감사 및 PROFS 감사합니다. H2B-RFP 및 H2A-GFP 구조를 생성하기위한 PCS2 + 플라스미드 박사 윌킨슨의 제공을위한 터너와 렆. 우리는 우리의 동물을 돌보는에 대한 FishCore 시설 직원 (모나 쉬 대학) 감사합니다.

모든 절차는 동물의 관리 및 사용에 대한 실천의 호주 국립 보건 의료 연구 협의회 코드의 규정에 따라 수행하고, 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다. Zebrafish의 1. 준비 <ol><li> 성인 물고기 페어링 <ol><li> 저녁은 사용하기 전에 적절한 크기 사육 탱크 쌍 (또는 2 쌍)으로 성인 물고기를 설정합니다. </li><li> 남성에서 분리 된 여성을 유지하기 위해 볼 수있는 물고기를 사용하?...

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish:+EMBO+practical+course,+KIT,+Sept.+2013.">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23 (2013).</li><li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+in+the+vertebrate+retina.">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li><li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo.">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li><li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation.">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2.">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li><li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina.">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos.">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina.">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li><li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vsx2+in+the+zebrafish+retina:+restricted+lineages+through+derepression.">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14 (2009).</li><li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina.">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li><li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina.">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li><li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+cell-fate+determination:+lessons+from+the+retina.">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li><li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo.">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2 (2006).</li><li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alx,+a+zebrafish+homolog+of+Chx10,+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits.">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li><li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord.">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing.">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos.">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish.">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li><li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZebraBeat:+a+flexible+platform+for+the+analysis+of+the+cardiac+rate+in+zebrafish+embryos.">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898 (2014).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas.">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li><li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish,+Fundulus+heteroclitus.">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li><li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenesis+in+the+monkey+retina.">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li><li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina.">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li><li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+goldfish+retina.">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li><li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina.">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li></ol>

효율적 특정 포스트 - 유사 분열 세포 유형 또는 패터닝 된 조직으로 분화하는 배아 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포를 지시하는 것을 목표로 할 때 넓이가있는 이웃하는 셀은 중요한 세포의 운명 결정 인자의 발현의 타이밍에 영향을 이해하는 것이 필수적이다. 또한, 살아있는 동물의 개발 세포에서 이러한 분자 이벤트를 검사하면 추가로 관련 동적 생체 내에서 이러한 이벤트와 관련된 특...

<html> 생체 내 척추 동물의 중요한 발달 과정을 시각화하는 능력은 정상과 질병 조건을 공부 제브라 피쉬에게 키 모델을 만들기에 기여하고있다 (1 검토, 2). 특히, 신경 망막은 중추 신경계의 접근 가능한 부분이다. 망막 인해 고도로 조직 아직 비교적 간단한 구조 및 척추 동물 종 3에서 고도로 보존 된 신경 세포 유형에 쉽게 신경의 연구를 수행하기 위해 빌려 준다. 이러한 증식, 세포주기 출구, 비대칭 세포 분열, 운명 사양, 차별화 및 신경 회로의 형성과 같은 세포 행동의 역학은 3 일의 postfertilization에 의해 제브라 피쉬의 중심 망막에 완료 retinogenesis의 전체 과정에 걸쳐 올 수 있습니다 ( DPF) 4, 5,REF &quot;&gt; (6, 7). 또한, 전술 한 각 단계에서 상이한 유전자의 기능적 요구 병용 단 후 부검시에 평가 될 수있는 유전자 녹아웃 기술의 적용으로 인한 표현형 다른 척추 동물 모델에 비해 이점을 제공 제브라 망막 평가할 수있다 의 조직을 고정. 특히, 시각화 및 망막 리포터 유전자 형광 단백질의 발현을 모니터 할 수있는 트랜스 제닉 라인의 사용은 우리가 특정 신경 세포 유형 기원의 기초의 유전자 발현의 시간 해상도를 얻을 수있다. 인해 지브라 피쉬의 급속한 발전으로, 이러한 이벤트는 따라서 신경 세포 식별 획득 및 셀의 동작과 관련하여 유전자 발현의 시간 중요도에 깊은 통찰력을 제공하여 전체 개발 기간을 시각화 할 수있다. 마지막으로,이 방법은 유전자 기능의 두 가지 주요 형태로 통계 결과 이식을 통해 키메라의 생성과 제브라 효율적으로 결합 될 수있다. 우선, 그들이 비 표지 야생형 환경에서 개발하면서 특정 유전자를 넉다운시킨 도너 배아에서 이식 세포 검사, 세포 자율 방식으로 유전자 기능에 대한 관련 정보를 얻을 수있게 해준다. 따라서, 그들은 일반적으로 더 이상 유전자 -4,6-에서 기능성 단백질을 생성 할 수 없다 전구 세포의 발달 운명 결과의 시험을들 수있다.이 표현되는 전구 세포 내 망막 운명 결정 인자의 기능에 관한 중요한 통계 리드 8,9. 이 방법을 활용하여, 우리는 많은 운명의 결정 요인 (예를 들어, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2가) 세포의 역할을하는 것으로 나타났습니다-autonomously 특정 망막 신경 세포의 운명을 구동하는 단계; 유전자 발현의 부족은 주로 유전자 녹다운 세포가 다른 세포 운명 4, 6, 7, 10을 채용하여 생존 유지되도록 운명 스위치로 이끈다. 둘째, 이러한 키메라 실험은 서로 다른 유전 적 환경에서 개발할 때 형 선조 동작 방식 야생 평가하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 일반적으로 조작 된 호스트 환경 (예를 들어, 유전자 녹아웃 / 최저) 대 WT 관심 (리포터 유전자)의 유전자를 발현 WT 세포의 발달을 비교하여, 유전자 발현 및 세포 운명 얻어진 효과를 평가할 수있다 . 호스트 환경의 특정 신경 세포 유형의 부재가 예를 들어, 소수 O로 분화 향해 바이어스 그들 셀 비 자율 방식으로 야생형 전구 동작에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다신경 세포 타입 4, 7, 11, 12을 r에 누락. 망막 신경 세포가 (13에서 검토) 특정 신경 세포 운명 결정하는 유전자의 순차적 초과 식 (운명의 유전자 발현)에 의해 보존 histogenic 위해 태어난 것을 감안할 때, 우리는 입증하기 위해 이러한 방법을 사용하는 방법 야생형 전구 세포의 운명 유전자 발현의 타이밍 이러한 전구 세포가 유도 된 비정상적인 세포 조성 망막 호스트 환경에서 개발할 때 영향을받습니다. 비교적 널리 사용되는 표준 및 기술의 조합은 망막 전구 세포를 8, 9 개발 운명 유전자 발현의 타이밍의 시험을 가능하게하는 방법을 여기에서는 증거 이러한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 당의 용이성으로 시간 경과 영상을 결합하는 실험 방법을 설명합니다전 생체 개발 제브라 피쉬 배아에 이식을 형성하는 개별 mosaically에게 발달 retinogenesis의 전체 기간 동안 표지 세포를 수행합니다. 기능 유전자 조작을 수행함으로써 어느 호스트 배아 도너 배아, 또는 둘 모두에서 하나의 유전자 기능의 셀 자율성을 평가할 수있다. 이 방법은 여기에 설명 된 개별 구성 요소가 적합있는 다른 시스템에서 유사한 연구 질문에 널리 적용 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>Agarose coated dishes can be prepared a few days prior, sealed with parafilm to prevent drying and stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose low melt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td>Can be prepared in larger volume, microwaved to liquify and then kept molte in 40C waterbath. 1 ml aliquots can be prepared (one for each group of embryos mounted).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube w/o filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0035</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosillicate glass capillary tube with filament</td>
			<td>SDR Scientfic</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>alternatives with similar diameter can be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass petri dishes (60 mm diameter)</td>
			<td>Science Supply</td>
			<td>1070506</td>
			<td>any glass alternative of any size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection tube (2m)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>524616004</td>
			<td>This connects the needle holder to the syringe during transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection mold (plastic mold with wedge-shaped protrusions)</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>PT-1</td>
			<td>alternatives with similar shape can be use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microneedle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>any alternative that fits the outside diameter of the injection needles can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microinjector</td>
			<td>Narishige or Eppendorf Femtojet</td>
			<td></td>
			<td>Pneumatic injector using gas pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Coherent Scientific</td>
			<td>M330IR</td>
			<td>similar alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-2000</td>
			<td>Settings used for this puller are: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Any needle puller can be used if it results in appropriate tip dimension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Interpath</td>
			<td>PM996</td>
			<td>any paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette plastic</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette glass</td>
			<td>Hirschmann Laborgeraete</td>
			<td>9260101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5942-25MG</td>
			<td>&#160;Protease Type XIV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-phenyl thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629-25G</td>
			<td>PTU is toxic and can be prepared as a stock solution to avoid frequent exposure to the powder, consult MSDS before purchase / use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiaquick gel extraction</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>any alternatives to purify DNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>any alternatives to purify RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 mMessage kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>AM1340</td>
			<td>any alternatives to transcribe DNA using SP6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of transgenic gene expression in individual retinal progenitors in chimeric zebrafish embryos to study cell nonautonomous influences

유전 적 및 기술적 장점은 제브라 척추 유전자 조작의 결과가 급속한 발달 기간 동안 생체 내에서 추적 될 수있는 키 모델 생물 만들었다. 다중 처리는 세포 증식, 유전자 발현, 세포 이동 및 형태 형성을 포함하여 연구 될 수있다. 중요한 것은, 이식을 통해 키메라의 생성을 용이하게 호스트 환경의 영향하에 모자이크 표시와 개별 세포의 추적을 가능하게 수행 될 수있다. 예를 들어, 개별 이식 공여자 세포 (모르 폴리 마이크로 인젝션을 통해 예를 들어) 호스트 배아 기능 유전자 조작 및 라이브 영상, 외부의 영향 (유 전적으로 변형 환경에 의해 제공되는) 셀 비 자립적 신호를 조합하여 평가 될 수있다. 여기서 우리는이 방식 세포 운명 determin의 타이밍에 대한 프록시로서 형광 유전자 발현의 개시를 비교하기 위해 사용되는 방법을 보여다른 유전 호스트 환경에서 ATION. 이 글에서 공여 세포를 표시 유전자 호스트 배아 최저 키메라 배아를 생성하는 데 사용되는 이식 기술을 설명하고, 제조 및 생체 저속 촛점에서 실행을위한 프로토콜을 일으킬 제브라 피쉬 배아 마이크로 인젝션을위한 프로토콜을 제공 여러 개의 배아의 영상. 이러한 유전자 발현의 개시에 따라 이벤트의 타이밍을 비교하면 특히 다단 촬상을 행하는 것은 매우 중요하다. 이것은 다수의 제어와 동시에 처리 실험 배아에서 데이터 수집이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 쉽게 장기 나 영상을 살 액세스 선택의 조직에서 외부의 영향에 대한 연구를 위해 확장 될 수있다, 이식이 이루어 배아 운명의지도에 따라 쉽게 대상이 될 수 있음을 제공했다.

이 작품은 야생형 망막 전구 세포가 morphant 호스트 배아 내에서 개발할 때 유전자 발현 타이밍의 변화를 평가하기 위해 실험 프로토콜을 제시한다. 실험 호스트 배아 망막 7, 26의 중간 태어난 수평 및 무 축삭의 interneurons 부족 Ptf1a의 morphants이다. 이러한 표준 제어 모르 주사 하였다 호스트 배아를 제어하기 위해 비교 하였다. ...

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In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

연구

발생학

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...