Name: a g-quadruplex dna-affinity approach for purification of enzymatically active g4 resolvase1
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1 at JoVE.com

Vi vill tacka våra finansieringskällor, inklusive en generös gåva från Ware Foundation (till JPV), National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (till PJS), och Ball State University start medel (till PJS). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.

1. Framställning av G4-DNA-strukturer som ska användas för rening av rG4R1 (Bildning av biotinylerat G4-DNA G-quadruplex) <ol><li> Beställ följande DNA-oligomer, som kallas Z33-Bio, vid en 1 umol-skala: 5 &#39;AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3&#39;. Säkerställa att biotindelen är vid 3&#39;-änden av oligomeren. </li><li> Förbereda 10x G4-buffert: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA och 2500 mM NaCl. </li><li> Resuspendera Z33 oligomeren i 250 mikroliter vatten (så att oligomeren koncentratio...

<ol>
	<li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures,+folding+patterns,+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions.">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li><li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes.">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li><li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA.">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li><li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome.">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li><li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter.">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li><li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+helicases.">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li><li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome.">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li><li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome.">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li><li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes.">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li><li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+RHAU+(DHX36)+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary.">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li><li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme.">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li><li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5'+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation.">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li><li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3'-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding.">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).</li><li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+helicase+RHAU+(DHX36)+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1.">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5'-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1.">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li><li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound,+DExH+protein+RHAU.">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li><li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation.">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).</li><li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis.">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX1,+DDX21,+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells.">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li><li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+(DEAH)/RNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells.">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li><li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU.">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li><li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU.">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li></ol>

Detta protokoll utgör en effektiv uttryck, rening och kvantifiering system för isolering av DHX36 genprodukten, G4-Resolvase1 (G4R1, även kallad RHAU och DHX36) (Figur 1). Detta protokoll använder två reningssteg: His-tag affinitetsrening på koboltaffinitetspärlor och enzymatisk rening på G4-DNA-konjugerade pärlor. Det senare steget är unik genom att den drar nytta av den snäva affinitet, hög specificitet och katalytisk avveckling aktivitet som rG4R1 har för G4 strukturer. Den snäva affini...

G4 strukturer är mycket stabila nukleinsyra-sekundärstrukturer som bildar inom guanin-rika regioner av DNA och RNA. G4 strukturer stabiliserade via Hoogsteen-bindningsinteraktioner och samordna bindning inom det centrala hålrummet med monovalenta katjoner (dvs. K + och Na +) som väsentligt bidrar till den anmärkningsvärda termiska stabiliteten hos G4 strukturer 1, 2. Tidiga bioinformatik studier tyder på att det humana genomet innehåller&gt; 375.000 &quot;potentiella G4 bildande motiv&quot; 3, 4. Nyare studie uppskattningar tyder på att antalet G4 motiv är högre med en faktor av 2-5 Maj, medan en annan studie förutspår 716,310 distinkta potentiella G4 bildande sekvenser i det mänskliga genomet 6. G4 bildande sekvenser är evolutionärt konserverade och inte slumpmässigt dispergerade igenomet. G4 motiv anrikas i genen kodande regioner, och uppemot 40% av alla genpromotorer innehåller G4 motiv 7. Intressant nog har graden av anrikning av G4 motiv i en gen som visats för att föreslå den funktionen av genen. Till exempel, proto-onkogener och gener som är involverade i utveckling har betydligt större anrikning av G4 strukturer än tumörsuppressorgener 8, 9. Med hög termisk stabilitet, ett nästan allmänt förekommande inom genomet, och potentialen att signifikant påverka viktiga cellulära processer, är det förvånande att finna att cellen har utvecklats enzymer för att hantera dessa strukturer. Ett sådant enzym är G4 Resolvase1 (G4R1; även kallad RHAU och DHX36), som vi kännetecknas som källa för huvuddelen av tetramolecular G4-DNA lösa aktivitet i humana (HeLa) celler 10. Sedan dess har det visats that G4R1 tätt binder och katalytiskt unwinds tetramolecular och unimolekylär G4-DNA och G4-RNA med de trängsta rapporterade KDer för en G4-bindande protein 11, 12, 13. Dessutom har G4-lösa aktiviteten av G4R1 implicerats i ett brett spektrum av biokemiska och cellulära processer, inklusive telomer / telomeras biologi 11, 14, 15, 16, transkription och splitsning 17, 18, 19, 20, utveckling 21, hematopoes 21, och immunreglering 22, 23. Med en övervikt av G4 sekvenser specifikt belägen i hela genomet och de olika cellulära processes att G4R1 har nyligen varit inblandad för att vara med, förmågan att uttrycka och effektivt rena högaktiv rG4R1 kommer att vara av yttersta vikt för att klargöra de biokemiska mekanismer och beteenden hos detta protein. Här visar vi en ny uttryck och reningsschema (Figur 1) som utnyttjar ATP-beroende, G4-lösa aktivitet rG4R1 att effektivt isolera aktivt enzym. Detta system skulle kunna anpassas för att rena andra ATP-beroende nukleinsyra-enzymer för vilka produkten av den enzymatiska reaktionen är inte längre ett substrat för bindning, vilket är fallet för G4R1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TriEx4-DHX36 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>68368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosetta2(DE3)plysS competent cells</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71403-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544034&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Terrific Broth</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>243820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td>35 &#181;g/ml in bacterial plates/large cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (plant cell culture tested)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3416</td>
			<td>50 &#181;g/ml in bacterial plates/large cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH=8</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>1963-B</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl pH=7</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>1966</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 M Tris-HCl, pH=8.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl, pH=6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-Acetate, pH=7.8</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>1981</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (1 M solution)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>1665</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol (2-BME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin hemisulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin paramagnetic beads</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Z5482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH=8&#160;</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>0718</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M EDTA, pH=6</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td></td>
			<td>From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt metal affinity beads</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (from bacterial source)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % Sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td>Universal Scientific Supply Co.&#160;</td>
			<td>1667</td>
			<td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TBE&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11666703001</td>
			<td>or From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>411019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad Range Protein MW markers</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Z33 oligo (&#34;Z33-Bio&#34;)</td>
			<td>Oligos Etc</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAMRA-Z33 oligo (&#34;Z33-TAM&#34;)</td>
			<td>Oligos Etc</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluor-coated TLC plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM10110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2637</td>
			<td>30% in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie R-250</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiband UV lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of emitting UV light at 365 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of being cooled to 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of being cooled to 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Sonfier</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For formation of Z33 into quadruplex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator for bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C/14&#160; &#176;C shaking incubator for bacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strip tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2.0 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml centrifuge bottles (polypropylene)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3141-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard array of pipet tips and serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-loading tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic repeating pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For quick aliquoting of rG4R1; From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemlli sample buffer&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apparatus for running large slab gels</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td>We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12301D</td>
			<td>We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper and funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass casserole dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear sheet protectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner and associated TWAIN software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From standard source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Such as Fuji Multiguage, or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a g-quadruplex dna-affinity approach for purification of enzymatically active g4 resolvase1

Högre ordningens nukleinsyrastrukturer kallas G-quadruplexes (G4S G4 strukturer) kan bildas i guanin-rika regioner av både DNA och RNA och är mycket termiskt stabil. Det finns&gt; 375.000 förmodade G4 bildande sekvenser i det mänskliga genomet, och de anrikas i promotorregioner, oöversatta regioner (UTR), och inom telomer upprepa. På grund av risken för dessa strukturer att påverka cellulära processer, såsom replikation och transkription, har cellen utvecklats enzymer för att hantera dem. Ett sådant enzym är G4 resolvas 1 (G4R1), som biokemiskt samarkännetecknas av vårt laboratorium och Nagamine et al. och fann att binda mycket tätt till båda G4-DNA och G4-RNA (Kd i låga pM range). G4R1 är källan till de flesta av G4-lösa aktivitet i HeLa-cellysat och har sedan dess varit inblandad för att spela en roll i telomer metabolism, lymfa utveckling, gentranskription, blodbildningen och immunövervakning. Förmågan att EFligt uttrycka och rena katalytiskt aktiv G4R1 är av betydelse för laboratorier som är intresserade av att få ytterligare insikt i den kinetiska interaktionen mellan G4 strukturer och G4-lösa enzymer. Här beskriver vi en detaljerad metod för rening av rekombinant G4R1 (rG4R1). Det beskrivna förfarandet omfattar den traditionella affinitetsbaserad rening av en C-terminal histidin-märkta enzym uttryckt i humana kodonoptimerade bakterier med utnyttjande av förmågan hos rG4R1 att binda och koppla G4-DNA för att rena starkt aktivt enzym i en ATP- beroende elueringssteg. Protokollet innefattar även en kvalitetskontrollsteg där den enzymatiska aktiviteten hos rG4R1 mäts genom att undersöka förmågan hos det renade enzymet för att koppla G4-DNA. En metod beskrivs också som möjliggör för kvantifiering av renat rG4R1. Alternativa anpassningar av detta protokoll diskuteras.

Detta protokoll (Figur 1) rutinmässigt ger nästan ren, katalytiskt aktiv rG4R1. Som ett mått på enzymatisk aktivitet, är det typiskt observerat att 50% av 0,2 pmol av TAMRA-märkta tetramolecular G4-DNA omvandlas till monomerer inom 0,2-0,013 il intervallet rG4R1, enligt analys med G4 aktivitetsanalysen som beskrivits ovan (Figur 2). Coomassie-färgning av renat rG4R1 visar ett enda band vid den förväntade storleken 120 kDa, med en mindre förorenande band vid ~ 75 kDa, vilket ka...

Watch this Scientific Journal Video about A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1 at JoVE.com

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

G4 Resolvase1 binder till G-quadruplex (G4) strukturer med de snävaste rapporterade affinitet för en G4-bindande protein och representerar majoriteten av G4-DNA avlindning aktivitet i HeLa-celler. Vi beskriver en ny protokoll som utnyttjar affinitet och ATP-beroende avveckling aktivitet av G4-Resolvase1 att specifikt rena katalytiskt aktivt rekombinant G4R1.

En G-quadruplex DNA-affinitet metoden för rening av enzymatiskt aktiva G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile och effektiv strategi för produktion av Vändbar disulfid Tvärbundna Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Rening och beredning av TRPV1 för spektroskopisk analys

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

En anpassningsbar metod för enzymatisk produktion och rening av Diterpenoid naturliga produkter

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...