Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

كانت AB وEM موظفي شركة التبغ البريطانية الأمريكية في وقت كتابة هذه المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل الموصوف في هذه المخطوطة من قبل شركة التبغ البريطانية الأمريكية، ودفعت رسوم النشر لهذا الفيديو المقال من قبل شركة التبغ البريطانية الأمريكية.

حاليا، العديد من أنظمة اختبار السمية موحدة تستخدم بكتيريا مهندسة، خطوط الخلايا أو الخلايا الجنينية التي ليست ممثلة التمثيل الغذائي الإنسان العادي 1. هذا يمكن أن يؤدي إلى توقعات غير دقيقة من النشاط السامة المحتملة لمادة كيميائية أو دواء. مبتكرة نماذج في المختبر، مثل مزارع الخلايا 3D والجهاز على شريحة، يجري تطويرها في محاولة لتكرار أفضل التشكل الطبيعي والنشاط الأيضي للأنسجة البشرية 21 و 22 و 23. الكفاءة الأيضية هي معيار واحد التي يمكن استخدامها على فك التي هي الأنسب نماذج لدراسات تقييم والتحول الأحيائي المخدرات السمية. تم تصميم بروتوكول ذكرناها في هذه الورقة لقياس نشاط الانزيمات CYP باستخدام الخلايا الحية. أنها مرنة، ويمكن استخدامها لأنظمة مختلفة من الخلايا في 2D أو 3D الثقافيهوفاق ويوفر خيار لاستخدام إما probe- luminogenic أو النهج القائم على قياس الطيف الكتلي. كلتا الطريقتين حساسة بما يكفي للكشف عن كميات نانوغرام من المواد وتتطلب سوى عدد قليل من الخلايا المزروعة في شكل multiwell. كما يمكن تطبيقها على كروي أو خلايا نمت في مصفوفات معقدة. اختيار الركيزة التحقيق ومن الواضح أن عنصرا حاسما في البروتوكول. خصوصية الفحص تعتمد على التحقيق يجري انتقائية للانزيم CYP وطبقة أخرى من الضمان يمكن الحصول عليها عن طريق استخدام مثبط CYP انتقائي. ركائز ومثبطات المدرجة في هذه الورقة هي مجرد أمثلة قليلة، ولكن الآخرين يمكن العثور عليها في الأدب. من المهم أن تنظر في حضانة مرات متعددة عند العمل مع نوع من الخلايا الجديدة كما CYP نتيجة النشاط السلبية يمكن أن يكون راجعا إلى إنزيم يجري التعبير عنه عند مستوى منخفض. بالإضافة إلى وجود نوع من الخلايا التي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية مستحسنة لضمان أنلا يرتبط نتائج سلبية لقضية فنية وللمساعدة في أي حل المشاكل. خلايا الكبد الأساسية هي المختصة عملية الأيض، ويمكن استخدامها لمكافحة، على سبيل المثال خلايا الكبد الأولية في تعليق من السهل جدا للاستخدام ولكن قدرتها على الاستمرار محدودة في الوقت المناسب. خطوط الخلايا الكبدية هي البدائل الممكنة التي من السهل نسبيا للاستخدام كما هو موضح في هذا البروتوكول، ولكن بعضها أفضل من غيرها من حيث النشاط الأيضي 6، 21. منذ الاختبار هو غير مدمرة، ما لم يكن كميا البروتين الكلي، فمن الممكن لمتابعة النشاط CYP مع مرور الوقت في الدراسات الطولية 20. وهذه نقطة مهمة لأن بعض الخلايا سيكون النشاط CYP متغير مع مرور الوقت في الثقافة. قد تكون مرتبطة النتيجة السلبية مع عدم وجود confluency، تقدم مع تمايز أو فقد التمايز في المختبر. في هذه الحالة، فإن هذا النهج هو شبه quantitati-لقد لأنه لا تطبيع البيانات عن طريق المبلغ الإجمالي من البروتين في كل ثقافة الخلية. وليس من الممكن دائما أو الموصى بها لإعادة النسيج بعد قياس النشاط CYP عن التعرض للتحقيقات، مثبطات أو محرضات يمكن أن يكون لها تأثير سام على الأنسجة كما هو الحال بالنسبة لTCDD. ويمكن أيضا أن أجزاء الخلية مثل microsomes ل أن تستخدم لوصف النشاط CYP من نوع خلية معينة. صغرور الاستعدادات، ومع ذلك، تتطلب الكثير من المواد الخلية، إضافة العوامل المساعدة الكافية والعازلة للتأكد من أن الإنزيمات تبقى نشطة. استخدام الخلايا الحية يلغي خطوة إعداد صغرور صعبة والعمل بها والتي مخازن والعوامل المساعدة بشكل أفضل. كما توصية عامة، بل هو أفضل الممارسات لزيادة تميز الشخصية تعبير عن CYPs في مزارع الخلايا للتحقق من أن يطابق النشاط الأنزيمي. وأوصى نظرا لهذا مستوى إضافي من التحقق من أن تحقيقات التمثيل الغذائي لا انتيتعتمد محددة لCYP واحد، وأنه يعطي زيادة الثقة في أن النشاط الأيضي قياس يقابله التعبير انزيم المقابلة. منذ CYPs هي بروتينات غشاء أنها صعبة نسبيا للتحضير لالبقع الغربية، وبالتالي الكمي RT-PCR كان النهج المفضل لمحة هذه الانزيمات 20. ومن المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول يصف طريقة لنشاط انزيم فحص CYP أن يمثل سوى عائلة واحدة من الإنزيمات الأيضية، وإن كانت هامة. مرونة نهج قياس الطيف الكتلي تسمح للتطوير أساليب اكتساب لالتحولات الأيضية الأخرى من ركائز التحقيق. ومع ذلك، فقد لتطوير تلك في وقت واحد، وهناك عدد أقل حاليا تحقيقات محددة معروفة ومثبطات انتقائية للأسر انزيم الأيضية الأخرى. وينبغي معالجة هذه الفجوة لإتاحة إجراء تقييم شامل لكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر خلية التنفسيالآنسة.

الأيض أجنبي بيولوجيا هو عملية يتم من خلالها تعديل المواد الكيميائية الأجنبية إلى الجسم عن طريق إضافة مجموعة ماء وتقارن لتسهيل إفراز من 1. عادة عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك هو عملية من خطوتين مع المرحلة الأولى التي تتكون في الغالب من الأكسدة مع إضافة واحدة أو عدة مجموعات الهيدروكسيل 1 و 2. في المرحلة الثانية، يتم استخدام مجموعة الهيدروكسيل كما يقبلون لالمترافقة ماء مثل غلوكورونيد أو شاردة كبريتات 1 و 2. إذا كانت المجموعة متقبل هي بالفعل موجودة على الجزيئات، يمكن أن الخطوة الاقتران يحدث بشكل مستقل عن المرحلة الأولى الأيض. يتم تنفيذ كل رد فعل من قبل مجموعة محددة من الانزيمات، على سبيل المثال، CYPs (السيتوكروم P450s)، التي تحفز على الهيدروكسيل (الشكل 1) ونزع الألكلة من ركائز الكيميائية 3. Conjugatioن ويحفزه sulfotransferases، UDP-glucuronosyltransferases (الشكل 1)، الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز وN-acetyltransferases 4. وسيكون لكل الأنسجة والأعضاء لديهم الأيض تعريف معين التعبير الانزيم، مع الكبد معربا عن معظم هذه البروتينات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> الشكل 1: مثال من المرحلة الأولى والمرحلة الثانية الأيض لالكومارين. CYP2A6 / CYP2A13 تحفيز-الهيدروكسيل 7 من الكومارين. ومترافق 7 hydroxycoumarin إلى شاردة غلوكورونيد من المرحلة الثانية الانزيمات UGTs، مع UGT1A6 وUGT1A9 تظهر أعلى نشاط. فهم عملية التمثيل الغذائي للالاكسيوبيوتك أمر بالغ الأهمية في تقييم مأمونية الأدوية ولتقييم المخاطر الكيميائية وذلك لسببين: سوف حركية التفاعل تحديد متى دواء أو مادة كيميائية سوف تبقى في الجسم في شكل نشطة أو غير نشطة بإفراز efore. والمركب الأصلي يمكن تعديل إلى أنواع أكثر على رد الفعل، غير مستقر والسامة بواسطة أنزيمات التمثيل الغذائي. ردود الفعل هذه التي تعرف أيضا باسم &quot;التنشيط الحيوي&quot; هي التي تحرك معظمهم من المرحلة الأولى CYP الأنزيمات ولكن أيضا في مناسبات نادرة من المرحلة الثانية الاقتران 5. وبناء على هذا، فإن قدرة نموذجا في المختبر على التنبؤ بدقة المخاطر المرتبطة دواء أو مادة كيميائية تعتمد بشكل كبير على كفاءة التمثيل الغذائي للنظام الخلية. خطوط الخلايا المشتقة من الأنسجة المريضة أو من تحول الخلايا الطبيعية كثيرا ما تفقد جزءا إن لم يكن كل من الأيض الشخصي انزيم ممثل أنسجتهم من أصل 6. الحفاظ على البيانات الشخصية انزيم الأيض الطبيعي يبدو أفضل في مزارع الخلايا الأولية (على الأقل في المدى القصير الثقافات) وتحسنت مرة أخرى إذا كانت الأنسجة مثقف في مصفوفة والسماح لها بالاحتفاظ هيكل 3D في 1. ولذلك، فإن شارacterization من كفاءة التمثيل الغذائي في المختبر نظام خلية خطوة أولية هامة في توجيه القرار بشأن أي نموذج الخلية المناسب لإجراء تقييمات للسلامة الكيميائية. في هذه الورقة نقدم بروتوكول لمحة عن النشاط والتعبير عن الانزيمات المرحلة الأولى CYP في المختبر مع أمثلة من تطبيقها مع خط الخلية الكبدية 7 و 3D الرئة الأولية الثقافات خلية 8. موصوفة CYP ركائز محددة ومنتجاتها الأيضية والمانع الضوابط جنبا إلى جنب مع spectrometry- كتلة وأساليب القياس الكمي يستند luminogenic. منذ بعض CYPs هي محرض والبعض الآخر التأسيسي، كما سيتم إعطاء أمثلة لهذه السيناريوهات اثنين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

أنزيمات استقلاب أجنبي بيولوجيا تلعب وظيفة أساسية في التحول الأحيائي من الأدوية والمواد السامة بإضافة المجموعات الوظيفية التي تزيد من الذوبان وتسهيل إفراز. في بعض الأحيان تلك التعديلات الهيكلية تؤدي إلى تشكيل المنتجات السامة الجديدة. من أجل الحد من التجارب على الحيوانات، المخاطر الكيميائية يمكن تقييم استخدام الخلايا المختصة عملية الأيض. التعبير عن الأنزيمات الأيضية، ولكن، ليست مستقرة على مر الزمن في العديد من أنظمة ثقافة الأولية في المختبر وغالبا ما يكون جزئيا أو غائبة في خطوط الخلايا. ولذلك، ينبغي من الناحية المثالية أن تجرى دراسة الأدوية والمواد المضافة، والبيئية الأيض الملوثات في المختبر في النظم الخلية حيث اتسم النشاط الأيضي. نشرح هنا نهجا لقياس نشاط فئة من الإنزيمات الأيضية (المرحلة الإنسان I) في خطوط الخلايا 2D و 3D الثقافات الأولية باستخدام المجسات الكيميائية ومنتجاتها الأيضية القابلة للقياس من قبل UPLC قياس الطيف الكتلي وluminometry. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة لاختبار النشاط الأيضي في خطوط الخلايا والخلايا الأولية المستمدة من مجموعة متنوعة من الأنسجة.

وترد أمثلة على النشاط الأيضي قياس لاثنين من أزواج من CYPs (CYP1A1 / 1B1 وCYP2A6 / 2A13) في مزارع الخلايا الهوائية من ثلاث جهات مانحة مختلفة (مجرى الهواء M360، M370، M417) وخط الخلية الكبدية (خط التهاب الكبد) في الشكل (6) 20. النشاط CYP تقاس luminometry ويبين الشكل 6A التلألؤ النسبي الناجم عن النشاط CYP1A1 / 1B1 O-نزع الألكلة لوك-CEE (وسيفيرين 6&#39;-chloroethyl الأثير) في خلايا الشعب الهوائية (3 المانحين) وخلايا الكبد مع وبدون TCDD الاستقراء. CYP1A1 / 1B1 هي الانزيمات محرض للغاية وعادة ما تكون غير وأعرب على المستوى التأسيسي في معظم الأنسجة. كما يمكن أن يرى في الشكل 6A، لم يتم الكشف عن إشارة luminogenic عندما لا يسببها الخلايا. عند كل أنواع الخلايا وقبل المحتضنة مع TCDD، قوي CYP1A1 / 1B1 محفز، علامةتم الكشف عن إشارة إد luminogenic مقارنة بالمجموعة الضابطة (الشكل 6A). هذا يدل على أن التحقيق لوك-CEE تم استقلاب الرائدة إلى الإفراج عن شاردة وسيفيرين أن وكميا في وقت لاحق. عموما النشاط من خط الخلية الكبدية TCDD معاملة أقل مما كانت عليه في خلايا الشعب الهوائية، حتى بعد تطبيع مجموع البروتين. هذا ليس من غير المألوف منذ خطوط الخلايا تميل إلى أن تكون أقل نشاطا أيضي من الخلايا الأولية. إضافة α-naphthoflavone لها تأثير كابح بشكل واضح على النشاط CYP1A1 / 1B1 في جميع أنواع الخلايا مما يؤكد كذلك CYP التبعية الأيض لوك-CEE. الكمي لنواتج CYP450 باستخدام UPLC-MS ويوضح الشكل 6B تقدير حجم CYP2A6 / النشاط 2A13 في خلايا الشعب الهوائية من 3 المانحين (مجرى الهواء M343، M345، M347) والخلايا الكبدية (خط التهاب الكبد) بعد الحضانة مع الكومارين في وجود وغياب inhibitor 8 ميثوكسي. وتطبيع البيانات عن البروتين الكلي. في السيطرة الكومارين الحضانة 0 دقيقة، تم الكشف عن عدم hydroxycoumarin 7 (الشكل 6B). وأعرب CYP2A6 / 2A13 جوهري في أنسجة معينة وبالتالي يتم الكشف بعد 16 ساعة الحضانة مع تشكيل الكومارين من 7 hydroxycoumarin في أنواع مختلفة من الخلايا اختبار، حتى من دون تحريض. عندما 8 ميثوكسي، يضاف مثبط CYP2A (الشكل 6B)، يتم تقليل تشكيل 7 hydroxycoumarin إلى حد كبير. وتجدر الإشارة إلى أنه في وجود المانع CYP، فمن الطبيعي أن لا يزال الكشف عن بعض النشاط المتبقي كما تثبيط نادرا ما كاملة ومنذ CYPs أخرى قد تكون ايضا قادرة على التعرف على الركيزة ولكن معالجة ذلك أقل بكثير من الكفاءة. ويمكن أيضا ملاحظة أن النشاط الأيضي سجلت يمكن أن تكون مختلفة بين الجهات المانحة عند استخدام الخلايا الأولية كما هو الحال بالنسبة CYP2A6 في خلايا الشعب الهوائية مرئية(الشكل 6B). ومن المتوقع لهذا النشاط كما CYP من شأنه أن النمط الجيني كل جهة مانحة والأشكال. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> الشكل 6: آخر الفحص النتيجة لCYP1A1 / 1B1 آخر (A) وCYP2A6 / 2A13 النشاط (B) في خط خلية كبد وفي ثلاثة مجرى الهواء خلية الجهات المانحة (M360، M370، M417). يظهر (A) لوك-CEE النشاط نزع الألكلة مع وبدون تحريض CYP1A1 / 1B1 التي كتبها TCDD. α-naphthoflavone كانت تستخدم مثبطات CYP1A1 / 1B1. وأعرب عن النشاط وحدات النسبية التلألؤ (RLU) تطبيع قبل فترة حضانة في دقيقة (دقيقة) والبروتين الكلي (ملغ). (B) CYP2A6 / 2A13 لا تتطلب الاستقراء كما يعبر عنها بشكل جوهري. يظهر الكومارين النشاط 7 الهيدروكسيل في البروتينات بمول / دقيقة / ملغ في نقاط زمنية مختلفة مع وبدون المانع 8 methoxypsorألين. يتم عرض كل النتائج كقيمة يعني من ثلاثة قياسات مستقلة مع الانحرافات المعيارية للمتوسط. تم تعديل هذا الرقم من باكستر 20. التكميلي الجدول 1: UPLC وإعدادات مطياف الكتلة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

الكفاءة التمثيل الغذائي في المختبر الأنظمة هو شرط أساسي لأحيائي والتصرف فيها المخدرات والمواد السامة. في هذا البروتوكول، وصفنا تطبيق تحقيقات إشارة التمثيل الغذائي لتقييم المرحلة الأولى التمثيل الغذائي في مزارع الخلايا.

الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من<em&gt; في المختبر</em&gt; الثقافات خلية

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...