Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB og EM var ansat i British American Tobacco på det tidspunkt dette manuskript blev skrevet. Beskrevet i dette manuskript arbejde blev finansieret af British American Tobacco, og offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af British American Tobacco.

I øjeblikket er mange standardiserede toksikologiske testsystemer bruge gensplejsede bakterier, cellelinjer, eller embryonale celler, som ikke er repræsentative for den normale menneskelige stofskifte 1. Dette kan føre til unøjagtige forudsigelser af den potentielle toksiske aktivitet af en kemisk eller medicin. Innovative in vitro modeller, såsom 3D-cellekulturer og organ på en chip, der udvikles i et forsøg på bedre at replikere den normale morfologi og metabolisk aktivitet af humane væv 21, 22, 23. Metabolisk kompetence er et kriterium, der kan anvendes til at dechifrere hvilke modeller er bedst egnet til toksikologiske undersøgelser vurdering og lægemiddel biotransformation. Protokollen vi har skitseret i dette papir er designet til at måle aktiviteten af ​​CYP-enzymer ved hjælp af levende celler. Den er fleksibel og kan anvendes til forskellige cellesystemer i 2D- eller 3D-cultures og giver mulighed for at bruge enten en luminogent probe- eller en massespektrometri-baseret tilgang. Begge metoder er følsomme nok til at opdage nanogram mængder af materialer og kræver kun et lille antal celler dyrket i et flere brønde format. De kan også anvendes til sfæroid eller celler dyrket i komplekse matricer. Udvælgelsen af ​​sonden substratet er tydeligvis et kritisk element af protokollen. Specificiteten af ​​assayet beror på proben være selektiv for CYP-enzym og et andet lag af sikkerhed kan opnås ved anvendelse af en selektiv CYP inhibitor. De substrater og inhibitorer, der er anført i dette papir er blot et par eksempler, men andre kan findes i litteraturen. Det er vigtigt at overveje flere inkuberingstider når man arbejder med en ny celletype som en negativ CYP aktivitet resultat kunne skyldes enzymet, der udtrykkes på et lavt niveau. Tilsætningen af ​​en celletype, der kan anvendes som en positiv kontrol er tilrådeligt at sikre, at ennegativt resultat er ikke knyttet til et teknisk spørgsmål og til at hjælpe med enhver fejlfinding. Primære leverceller er metabolisk kompetente og kan bruges som kontrol, for eksempel primære hepatocytter i suspension er meget nemme at bruge, men deres levedygtighed er begrænset i tid. Hepatiske cellelinier er mulige alternativer, som er relativt let at bruge som beskrevet i denne protokol, men nogle er bedre end andre, hvad angår metaboliske aktivitet 6, 21. Da assayet er ikke-destruktiv, medmindre totalt protein kvantificeres, er det muligt at følge CYP-aktivitet over tid i længdesnitsundersøgelser 20. Dette er et vigtigt punkt, fordi nogle celler vil have variabel CYP-aktivitet over tid i kulturen. Et negativt resultat kan være forbundet med manglen på konfluens fremskridt med differentieringen eller dedifferentiering in vitro. I så fald, tilgangen er semi-quantitative da data ikke normaliseres ved den totale mængde af protein i hver celle kultur. Det er ikke altid muligt eller anbefalet at genbruge vævet efter måling af CYP-aktivitet som eksponering for prober, hæmmere eller induktorer kan have en toksisk virkning på væv som det er tilfældet for TCDD. Cellefraktioner, såsom mikrosomer kunne også anvendes til at karakterisere CYP-aktivitet af en given celletype. Mikrosomekstrakter præparater kræver imidlertid en masse cellemateriale, tilsætning af tilstrækkelige cofaktorer og buffer for at sikre, at enzymerne forbliver aktive. Ved hjælp af levende celler eliminerer tricky mikrosom forberedelse trin og arbejder ud som buffere og cofaktorer fungerer bedst. Som en generel anbefaling, er det en god praksis for yderligere at karakterisere ekspressionsprofilen af ​​CYP&#39;er i cellekulturer at kontrollere, at det passer til den enzymatiske aktivitet. Denne ekstra niveau af kontrol er anbefales, da de metaboliske sonder ikke er Entipåberåbe specifik for en enkelt CYP og det giver øget tillid til, at den målte metaboliske aktivitet modsvares af det tilsvarende enzym-ekspression. Da CYP&#39;er er membranproteiner de er relativt vanskelige at fremstille til western blots, derfor kvantitativ RT-PCR har været den foretrukne metode til at profilere disse enzymer 20. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol beskriver en fremgangsmåde til assay CYP enzymaktivitet, som kun repræsenterer en familie af metaboliske enzymer, omend vigtig. Fleksibiliteten i et massespektrometri metode tillader udviklingen af ​​erhvervelse metoder til andre metaboliske omdannelser af probesubstrater. Men de skal udvikles en ad gangen, og der er i øjeblikket færre kendte specifikke prober og selektive inhibitorer for andre metaboliske enzymer familier. Denne kløft bør behandles for at muliggøre en samlet vurdering af den metaboliske kompetence in vitro celle systeFrk.

Xenobiotisk metabolisme er den proces, hvorigennem kemikalier er fremmede for kroppen er modificeret ved tilsætning af hydrofile grupper og konjugater at lette deres udskillelse 1. Typisk metabolismen af xenobiotiske stoffer er en to-trins proces med fase I består hovedsageligt af en oxidation med tilsætning af en eller flere hydroxylgrupper 1, 2. I fase II er hydroxylgrupperne anvendes som acceptorer for en hydrofil konjugat såsom glucuronid eller et sulfat-del 1, 2. Hvis en acceptorgruppe er allerede til stede på molekylerne, kan konjugeringen trin ske uafhængigt af fase I-metabolisme. Hver reaktion udføres ved en specifik gruppe af enzymer, fx CYP&#39;er (cytochrom P450&#39;er), som katalyserer hydroxyleringen (figur 1) og dealkylering af kemiske substrater 3. Conjugation katalyseres af sulfotransferaser, UDP-glucuronosyltransferaser (figur 1), glutathion-S-transferaser og N-acetyltransferaser 4. Hvert væv og organ vil have en specifik metabolisk enzym ekspressionsprofil, med lever udtrykker de fleste af disse proteiner. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figur 1: Eksempel på fase I og fase II Metabolism for coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysere 7-hydroxylering af coumarin. 7-hydroxycoumarin er konjugeret til et glucuroniddelen ved fase II enzymer UGT&#39;er, med UGT1A6 og UGT1A9 viser den højeste aktivitet. Forståelse metabolismen af ​​xenobiotika er kritisk ved evaluering af lægemiddelsikkerhed og for risikovurdering af kemikalier af to grunde: reaktionskinetikken vil afgøre, hvor længe et lægemiddel eller kemisk vil forblive i kroppen i en aktiv eller inaktiv form before udskillelse; og stamforbindelsen kan modificeres til en mere reaktiv, ustabil og toksisk arter ved metaboliske enzymer. Sådanne reaktioner også kendt som &quot;bioaktivering&quot; er for det meste drevet af fase I CYP-enzymer, men også sjældnere lejligheder af fase II konjugering 5. Baseret på denne evne til en in vitro model til præcist at forudsige risikoen i forbindelse med et lægemiddel eller et kemikalie er meget afhængig af den metaboliske kompetence cellesystemet. Cellelinier afledt fra syge væv eller fra transformationen af normale celler mister ofte en del, hvis ikke alle af det metaboliske enzym er repræsentativ deres væv af oprindelse 6. Opretholdelsen af den normale metaboliske enzym profil vises bedre i primære cellekulturer (mindst i korttidskulturer) og er yderligere forbedret, hvis vævet er dyrket i en matrix gør det muligt at bevare sin 3D-struktur 1. Derfor trækulletacterization af det metaboliske kompetence et in vitro celle er en vigtig indledende skridt i en vejledning Beslutningen om, hvilke celle model er hensigtsmæssigt at gennemføre kemiske sikkerhedsvurderinger. I denne afhandling præsenterer vi en protokol til at profilere aktiviteten og ekspressionen af fase I CYP-enzymer in vitro med eksempler på deres anvendelse med en hepatisk cellelinie 7 og 3D primære lunge cellekulturer 8. CYP specifikke substrater, deres metaboliske produkter og inhibitor kontroller er beskrevet sammen med masse spectrometry- og luminogent-baserede kvantificeringsmetoder. Da nogle CYP&#39;er er inducerbare og andre er konstitutive, vil eksempler også blive givet til de to scenarier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

Xenobiotiske enzymer spiller en nøglefunktion i biotransformationen af ​​lægemidler og toksiske stoffer ved tilsætning af funktionelle grupper, som øger opløseligheden og lette udskillelse. Ved nogle lejligheder disse strukturelle modifikationer fører til dannelsen af ​​nye giftige produkter. For at reducere dyreforsøg, kan kemisk risiko vurderes ved anvendelse metabolisk kompetente celler. Ekspressionen af metaboliske enzymer er imidlertid ikke stabil over tid i mange in vitro primære dyrkningssystemer og er ofte delvis eller fraværende i cellelinier. Derfor bør ideelt gennemførte undersøgelsen af lægemidler, tilsætningsstoffer og miljømæssige forureninger metabolisme in vitro i cellesystemer hvor metabolisk aktivitet er blevet karakteriseret. Vi forklare her en fremgangsmåde til måling af aktiviteten af ​​en klasse af metaboliske enzymer (Human fase I) i 2D-cellelinjer og primære 3D kulturer under anvendelse af kemiske prober og deres metaboliske produkter kvantificerbare af UPLC massespektrometri ogluminometri. Fremgangsmåden kan gennemføres for at teste den metaboliske aktivitet i cellelinier og primære celler afledt fra en række væv.

Eksempler på metabolisk aktivitet målt for to par CYP&#39;er (CYP1A1 / 1B1 og CYP2A6 / 2A13) i luftvejene cellekulturer fra tre forskellige donorer (luftvejs M360, M370, M417) og den hepatiske cellelinie (Hep linie) er vist i figur 6 20. CYP-aktivitet målt ved luminometri Figur 6A viser den relative luminescens produceres af CYP1A1 / 1B1 O-dealkylering aktivitet af Luc-CEE (Luciferin 6&#39;-chlorethyl ether) i luftvejsceller (3 donorer) og leverceller med og uden TCDD induktion. CYP1A1 / 1B1 er meget inducerbare enzymer og er typisk ikke udtrykkes på en konstitutiv niveau i de fleste væv. Som det kan ses i figur 6A, er der ikke luminogent signal detekteres, når cellerne ikke induceres. Når begge celletyper er præinkuberet med TCDD, en stærk CYP1A1 / 1B1 inducer, et mærkeed luminogent signal detekteres sammenlignet med kontrollen (figur 6A). Dette indikerer, at Luc-CEE-proben er blevet metaboliseret førende til frigivelse af luciferin-del, er kvantificeret efterfølgende. Samlet aktiviteten fra TCDD behandlede hepatisk cellelinie er lavere end for de luftvejsceller, selv efter total protein normalisering. Dette er ikke usædvanligt, eftersom cellelinier tendens til at være mindre metabolisk aktive end primære celler. Tilsætning af α-naphthoflavon har en klar inhibitorisk virkning på CYP1A1 / 1B1-aktivitet i alle celletyper, som yderligere bekræfter CYP-afhængighed af Luc-CEE metabolisme. Kvantificering af CYP450 metabolitter anvendelse UPLC-MS Figur 6B illustrerer kvantificeringen af CYP2A6 / 2A13 aktivitet i luftvejsceller fra 3 donorer (Airway M343, M345, M347) og leverceller (Hep linie) efter inkubering med coumarin i nærvær og fravær af inhiBitor 8-methoxypsoralen. Dataene normaliseres for totalt protein. I 0 min cumarin inkubation kontrol, der ikke registreres 7-hydroxycoumarin (figur 6B). CYP2A6 / 2A13 udtrykkes konstitutivt i visse væv og derfor efter 16 timers inkubering med coumarin dannelse af 7-hydroxycoumarin er påvist i de forskellige testede celletyper, selv uden induktion. Når 8-methoxypsoralen tilsættes et CYP2A inhibitor (figur 6B), er dannelsen af 7-hydroxycoumarin betydeligt reduceret. Det skal bemærkes, at i nærværelse af CYP inhibitor, er det normalt at stadig finde nogen resterende aktivitet som inhibering er sjældent fuldstændig og da andre CYP&#39;er også kunne være i stand til at genkende substratet, men behandle det langt mindre effektivt. Det kan også bemærkes, at de registrerede metabolisk aktivitet kan være forskellig mellem donorerne ved brug primære celler, som det er synligt for CYP2A6 i luftvejsceller(Figur 6B). Dette forventes som CYP-aktivitet er ansvarlig for hver donor genotype og polymorfier. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figur 6: aktivitetsassay Resultat for CYP1A1 / 1B1 Activity (A) og CYP2A6 / 2A13 aktivitet (B) i Nedsat Cell Line og i tredje Airway Cell Donorer (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkylering aktivitet er vist med og uden induktion af CYP1A1 / 1B1 af TCDD. α-naphthoflavon blev anvendt som CYP1A1 / 1B1 inhibitor. Aktivitet udtrykkes som relative luminescensenheder (RLU) normaliseret ved inkubation i minutter (min) og totalt protein (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ikke kræver induktion som de udtrykkes konstitutivt. Coumarin 7-hydroxyleringsaktivitet i pmol / min / mg proteiner er vist ved forskellige tidspunkter med og uden inhibitoren 8-methoxypsoralen. Alle resultater er præsenteret som en middelværdi af tre uafhængige målinger med standardafvigelser af middelværdien. Dette tal blev modificeret fra Baxter 20. Supplerende Tabel 1: UPLC og massespektrometer indstillinger. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Metabolisk kompetence in vitro systemer er en afgørende forudsætning for biotransformation og disposition af narkotika og giftstoffer. I denne protokol, beskriver vi anvendelsen af ​​reference- metaboliske prober til at vurdere Fase I metabolismen i cellekulturer.

Massespektrometri og luminogent tilgange til Karakterisere Fase I Metabolisk Kompetenceudvikling af<em&gt; In vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...