Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB ו EM היו עובדי בריטיש אמריקן טבק בזמנו כתב היד הזה נכתב. העבודה המתוארת כתב היד הזה מומן על ידי בריטיש אמריקן טבק, ודמי פרסום עבור וידאו-במאמר זה שולמו על ידי בריטיש אמריקן טבק.

נכון לעכשיו, מערכות בדיקה טוקסיקולוגית סטנדרטיות רבות להשתמש בחיידקים מהונדסים, שורות תאים, או תאים עובריים כי הם אינם מייצגים את חילוף החומרים האנושיים הרגיל 1. זה יכול להוביל תחזיות מדויקות של הפעילות הרעילה הפוטנציאל של חומר כימי או רפואה. חדשני במודלים חוץ גופייה, כגון תרביות תאי 3D ו איבר על שבב, מפותחים בניסיון לשכפל את המורפולוגיה הנורמלית יותר ופעילות מטבולית של רקמות אנושיות 21, 22, 23. מיומנות מטבולית היא קריטריון אחד שיכול לשמש כדי לפענח איזה דגמים מתאימים ביותר ללימודי הערכה טוקסיקולוגית biotransformation סמים. פרוטוקול גיבשנו במאמר זה נועד למדוד את הפעילות של אנזימים CYP באמצעות תאים חיים. היא גמישה ויכולה לשמש מערכות תאים שונות ב cultur 2D או 3Des ומציעה את האפשרות להשתמש גם probe- luminogenic או בגישה מבוססת ספקטרומטריית מסה. שני השיטות רגישות מספיק כדי לזהות כמויות ננוגרם של חומרים ורק דורש מספר קטן של תאים שגודלו במתכונת multiwell. הם יכולים להיות מיושמים גם אליפטית או תאים שגודלו מטריצות מורכבות. הבחירה של המצע החללי היא ללא ספק אלמנט קריטי של הפרוטוקול. הספציפיות של assay מסתמך על בדיקה להיות סלקטיבי של האנזים CYP ואת שכבה נוספת של ביטחון ניתן להשיג על ידי שימוש במעכבי CYP סלקטיבית. מצעי המעכבים המפורטים במאמר זה הם רק כמה דוגמאות, אבל אחרים ניתן למצוא בספרות. חשוב לשקול מספר פעמי דגירה כאשר עובד עם סוג תא חדש כתוצאת מפעילות CYP שלילית יכול להיות בגלל האנזים לידי ביטוי ברמה נמוכה. התוספת של סוג תא שיכול לשמש כביקורת חיובית רצויה להבטיח כיתוצאה שלילית אינה קשורה לבעיה טכנית וכדי לעזור עם כל בעיות. תאי כבד ראשיים הם מוסמך מטבולית ויכולים לשמש מלא, עבור hepatocytes העיקרי למשל השעיה קלה מאוד להשתמש אך הכדאיות שלהם מוגבלת בזמן. שורות תאים כבדית הם חלופות אפשריות אשר קל יחסית להשתמש כמתואר בפרוטוקול זה, אך חלקם טובים יותר מאחרים מבחינת פעילות מטבולית 6, 21. מאז assay אינה הורסת, אלא אם החלבון הכולל מכמתים, אפשר לעקוב אחר פעילות CYP לאורך זמן במחקרי אורך 20. זוהי נקודה חשובה מאחר שחלק מהתאים יהיו פעילות CYP משתנית לאורך זמן בתרבות. תוצאה שלילית עלולה להיות קשורה לחוסר confluency, התקדמות עם בידול או dedifferentiation במבחנה. במקרה כזה, הגישה היא חצי quantitative מאחר שהנתונים לא מנורמלים לפי כמות החלבון הכולל בכל תרבית תאים. זה לא תמיד אפשרי או מומלץ לעשות שימוש חוזר הרקמה לאחר מדידת פעילות CYP כחשיפת בדיקות, מעכבים או מעוררים יכול להיות השפעה רעילה על הרקמה כמו במקרה של TCDD. שברים ניידים כגון microsomes יכולים לשמש גם כדי לאפיין את פעילות CYP של סוג תא נתון. גוּפִיפוֹן הכנות, לעומת זאת, דורשות הרבה חומר תא, התוספת של קו-פקטורים נאותים חיץ על מנת להבטיח כי האנזימים להישאר פעילים. שימוש בתאים חיים מבטלת את הצעד הכנה גוּפִיפוֹן מסובך ועבודה אילו מאגרים קו-פקטורים פועלים בצורה הטובה ביותר. כהמלצה כללית, זהו נוהג טוב ביותר להמשיך לאפיין את פרופיל הביטוי של CYPs בתרביות תאים כדי לוודא שהוא תואם את הפעילות האנזימטית. רמת האימות נוספת זה מומלץ בהתחשב בכך בדיקות מטבוליות אינן entiלהסתמך ספציפי CYP אחת וזה נותן אמון מוגבר כי הפעילות המטבולית הנמדדת השתווה ביטוי האנזים המקביל. מאז CYPs הם חלבוני בממברנה הם קשים יחסית להתכונן כתמים מערביים, ולכן כמוני RT-PCR כבר הגישה המועדפת לפרופיל אנזימים אלה 20. חשוב לציין כי פרוטוקול זה מתאר שיטה פעילות האנזים CYP assay שרק מייצג משפחה אחת אנזימים מטבוליים, אם כי חשוב אחד. הגמישות של גישה ספקטרומטריית מסה מאפשרת הפיתוח של שיטות רכישה עבור טרנספורמציות מטבוליות אחרות של מצעים חלליים. עם זאת, אלה יש לפתח אותם אחד בכל פעם, יש כיום פחות ידוע בדיקות ספציפיות ומעכבי סלקטיבית למשפחות אנזים מטבוליות אחרות. צריך להתייחס זה פער כדי לאפשר הערכה מקיפה של מיומנות מטבוליות של syste תא במבחנה בגברת.

המטבוליזם Xenobiotic הוא התהליך שבאמצעותו כימיקלים זרים לגוף משתנים על ידי התוספת של קבוצות הידרופילי conjugates כדי להקל ההפרשה שלהם 1. בדרך כלל המטבוליזם של xenobiotics הוא תהליך דו-שלבי עם שלב I המורכב בעיקר של חמצון בתוספת קבוצות הידרוקסיל אחת או מספר 1, 2. בשלב ב &#39;, קבוצות הידרוקסיל משמשים acceptors עבור המצומד הידרופילי כגון glucuronide או מחצית סולפט 1, 2. אם קבוצת acceptor כבר מקיימת על המולקולות, צעד הנטייה יכול לקרות עצמאי של חילוף חומרים שלב I. תגובה לכל מבוצעת על ידי קבוצה ספציפית של אנזימים, למשל, CYPs (ציטוכרום P450s), כי לזרז את hydroxylation (איור 1) ו dealkylation של מצעים כימיים 3. Conjugation מזורזת על ידי sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases (איור 1), גלוטתיון-S-טרנספראז ו- N-acetyltransferases 4. כל רקמה ואיבר יהיה פרופיל ביטוי אנזים ספציפי מטבולית, עם הכבד להביע ביותר של חלבונים אלו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> איור 1: דוגמה שלב I ושלב II ומטבוליזם עבור Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 לזרז את coumarin-hydroxylation 7 של. 7-hydroxycoumarin הוא מצומדות כדי מחצית glucuronide ידי UGTs שלב II אנזימים, עם מראה UGT1A6 ו UGT1A9 הפעילות הגבוהה ביותר. הבין את חילוף חומרים של xenobiotics הוא קריטי בהערכת בטיחות תרופה ועל הערכת סיכונים כימית משתי סיבות: קינטיקה התגובה תקבע כמה זמן תרופה או כימי תישאר בגוף באופן b טופס פעיל או לא פעילהפרשת efore; יכול להיות משונה במתחם ההורה על מינים, לא יציבים ורעילים תגובתי יותר על ידי אנזימים מטבוליים. תגובות אלו ידועים גם בשם &quot;bioactivation&quot; מונעות בעיקר על ידי שלב I CYP אנזימים אלא גם בהזדמנויות נדירות על ידי נטיית שלב II 5. בהתבסס על זה, את היכולת של מודל במבחנה לנבא את הסיכון במדויק הקשורים תרופה או חומר כימי תלויה מאוד על מיומנות מטבוליות של מערכת התא. שורות תאים שמקורם לרקמות החולות או טרנספורמציה של תאים נורמליים קרובות מאבדים חלק אם לא את כל נציג פרופיל האנזים המטבולי של רקמת מוצאם 6. התחזוקה של פרופיל האנזים המטבולי הנורמלי נראית טובה יותר בתרביות תאים ראשוניות (לפחות בתרבויות בטווח קצרות), והוא השתפר עוד יותר אם הרקמה היא בתרבית מטריצה שמאפשרת לו לשמור על מבנה 3D שלה 1. לכן, characterization של מיומנות מטבוליות של מערכת תאים במבחנה ב מהווה צעד ראשוני חשוב המנחה את ההחלטה לגבי איזה דגם תא ראוי לערוך הערכות בטיחות כימיות. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל הפעילות והביטוי של אנזימי CYP שלב I במבחנה עם דוגמאות של היישום שלהם עם שורת תאים בכבד 7 ו תרביות תאי ריאות 3D עיקריות 8. מצעים ספציפיים CYP, המוצרים המטבולית שלהם מעכב השולט מתוארים יחד עם spectrometry- ההמוני ושיטות כימות מבוססות luminogenic. מאחר שחלק CYPs הם מושרה ואחרים אשר מכוננים, דוגמאות גם תינתן לשני תרחישים אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

אנזימים חילוף חומרים Xenobiotic לשחק תפקיד מפתח biotransformation תרופות toxicants ידי הוספת קבוצות פונקציונליות המגבירים מסיסות ולהקל הפרשת. בהזדמנויות כמה שינויים מבניים אלו להוביל להיווצרות של מוצרים רעילים חדשים. על מנת להפחית ניסויים בבעלי החיים, סיכון כימי ניתן להעריך באמצעות תאים מוסמכים מבחינה מטבולית. הביטוי של אנזימים מטבוליים, לעומת זאת, אינו יציב לאורך זמן ברבות במערכות תרבות העיקרית במבחנה, והוא בדרך כלל חלקית או נעדר בשורות תאים. לכן, במחקר של תרופות, תוספים, וחילוף חומרים מזהמים סביבתיים במבחנה רצויה להתנהל במערכות תא שבו פעילות מטבולית התאפיינה. אנו מסבירים כאן גישה למדידת פעילות של מחלקה של אנזימים מטבוליים (Phase אנוש I) בשורות תאי 2D ותרבויות 3D ראשוני באמצעות בדיקות כימיות ומוצרי מטבולית שלהם לכימות על ידי ספקטרומטריית מסה UPLC וluminometry. השיטה ניתן ליישם על מנת לבחון את הפעילות המטבולית של שורות תאים תאים ראשוניים שמקורם במגוון של רקמות.

דוגמאות של פעילות מטבולית נמדד עבור שני זוגות CYPs (CYP1A1 / 1B1 ו CYP2A6 / 2A13) ב תרביות תאים בדרכי הנשימה משלושה תורמים שונים (דרכי הנשימה M360, M370, M417) ואת שורת תאים בכבד (קו חפ) מוצגות באיור 6 20. פעילות CYP נמדדת luminometry איור 6 א מראה את ההארה יחסית המיוצרת על ידי CYP1A1 / 1B1 O-dealkylation הפעילות של לוק-CEE (Luciferin 6&#39;-chloroethyl אתר) בתאים בדרכי נשימה (3 תורמים) ותאי כבד עם ובלי אינדוקצית TCDD. CYP1A1 / 1B1 הם אנזימים מושרים מאוד ובדרך כלל אינם בא לידי ביטוי ברמה מכוננת ברוב הרקמות. כפי שניתן לראות באיור 6A, אין אות luminogenic מזוהית כאשר התאים אינם מושרים. כאשר שני סוגי התאים הם מראש מודגרות עם TCDD, inducer CYP1A1 / 1B1 חזק, סימןאות luminogenic ed מזוהית לעומת השליטה (איור 6 א). הדבר מעיד כי בדיקת לוק-CEE כבר מפורק מובילה לשחרור המחצית לוציפרין כי היא לכמת מכן. בסך הכל פעילות מקו התא הכבד שטופל TCDD נמוכות יותר עבור התאים בדרכי הנשימה, אפילו לאחר נורמליזצית חלבון כוללת. זה אינו חריג, מכיוון שורות תאים נוטים להיות פחות מבחינה מטבולית פעילה מאשר תאים ראשוניים. תוספת של α-naphthoflavone יש השפעה מעכבת ברורה על פעילות CYP1A1 / 1B1 בכל סוגי התאים אשר עוד מאשר את תלות CYP של המטבוליזם לוק-CEE. כימות של מטבוליטים CYP450 באמצעות UPLC-MS איור 6 ממחיש את כימות של CYP2A6 / 2A13 פעילות תאים בדרכי הנשימה מ 3 תורמים (Airway M343, M345, M347) ותאי הכבד (קו חפ) לאחר הדגירה עם coumarin של נוכחות והיעדרות של inhibitor 8-methoxypsoralen. הם מנורמל עבור חלבון כולל. בשנת לשלוט הדגירה coumarin 0 דק &#39;, לא 7-hydroxycoumarin מזוהה (6B איור). CYP2A6 / 2A13 בא לידי ביטוי constitutively ברקמות מסוימות ולכן אחרי 16 דגירת h עם היווצרות coumarin של 7-hydroxycoumarin מזוהה סוגי התאים השונים שנבדקו, אפילו בלי אינדוקציה. כאשר 8-methoxypsoralen, מעכב CYP2A מתווסף (איור 6), היווצרות של 7-hydroxycoumarin מצטמצם משמעותית. יצוין כי בנוכחות המעכבת CYP, זה נורמלי עדיין לזהות כמה פעילות שיורית כמו עיכוב הוא לעתים נדירות שלם מאז CYPs האחר עלול גם להיות מסוגל לזהות את המצע אבל לעבד אותו הרבה פחות יעיל. ניתן לראות גם כי פעילות מטבולית רשמה יכול להיות שונה בין התורמים בעת שימוש תאים ראשוניים כפי שהוא נראה לעין עבור CYP2A6 בתאים בדרכי הנשימה(איור 6 ב). זה צפוי כפעילות CYP עלולה כל גנוטיפ פולימורפיזם של תורם. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> איור 6: Assay פעילות תוצאה עבור CYP1A1 / 1B1 פעילות (א) ו- CYP2A6 / 2A13 פעילות (B) ב שורת תאים כבדיה וב שלוש Airway Cell תורם (M360, M370, M417). (א) לוק-CEE פעילות dealkylation מוצג עם ובלי אינדוקציה של CYP1A1 / 1B1 ידי TCDD. α-naphthoflavone שימש מעכב CYP1A1 / 1B1. פעילות מבוטאת ביחידות הארה יחסית (RLU) מתוקנן לפי זמן דגירה בתוך דקות (דקות) וחלבון כולל (מ&quot;ג). (ב) CYP2A6 / 2A13 אינו דורש אינדוקציה כפי שהם באים לידי ביטוי constitutively. Coumarin פעילות 7-hydroxylation בחלבונים pmol / דקות / מ&quot;ג מוצג בנקודות זמן שונות עם ובלי מעכב 8-methoxypsorאלן. כל התוצאות מוצגות כערך ממוצע של שלוש מדידות עצמאיות עם סטיות תקן של הממוצע. דמות זו שונתה מ בקסטר 20. שולחן משלימה 1: UPLC וספקטרומטר הגדרות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

מיומנות מטבולית של מערכות במבחנה ב הוא דרישת מפתח עבור biotransformation ומכירה של סמים toxicants. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את היישום של בדיקות מטבוליות התייחסות להעריך בשלב שאני המטבוליזם בתרביות תאים.

ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא תרבויות

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...