Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB e EM erano dipendenti di British American Tobacco, al momento questo manoscritto è stato scritto. Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato finanziato dalla British American Tobacco, e le spese di pubblicazione di questo video-articolo sono stati pagati dalla British American Tobacco.

Attualmente, molti sistemi di test tossicologici standardizzati utilizzano batteri ingegneristiche, linee cellulari o cellule embrionali che non sono rappresentativi della normale metabolismo umano 1. Questo può portare a previsioni inesatte del potenziale attività tossica di una sostanza chimica o medicina. Innovativo in vitro, quali colture cellulari 3D e organo su un chip, vengono sviluppati in un tentativo di replicare meglio la morfologia normale attività metabolica dei tessuti umani 21, 22, 23. competenza metabolica è un criterio che può essere utilizzato per decifrare quali modelli sono più adatti per gli studi di valutazione e di biotrasformazione di droga tossicologici. Il protocollo che abbiamo descritto in questo documento è progettato per misurare l&#39;attività degli enzimi CYP utilizzando cellule vive. È flessibile e può essere utilizzato per diversi sistemi cellulari in 2D o 3D culturES e offre la possibilità di utilizzare un probe- luminogenic o di un approccio basato su spettrometria di massa. Entrambi i metodi sono sufficientemente sensibili per rilevare quantità nanogrammi di materiali e richiedono solo un piccolo numero di cellule cresciute in un formato multipozzetto. Essi possono anche essere applicati a sferoide o cellule coltivate in matrici complesse. La scelta del substrato sonda è ovviamente un elemento critico del protocollo. La specificità del test si basa sulla sonda essere selettivi dell&#39;enzima CYP e un altro strato di affidabilità può essere ottenuta mediante l&#39;impiego di un inibitore selettivo CYP. I substrati e inibitori elencati nel presente documento sono solo alcuni esempi, ma altri possono essere trovati nella letteratura. È importante considerare diversi tempi di incubazione quando si lavora con un nuovo tipo di cella come CYP risultato negativo attività potrebbe essere dovuto al enzima è espressa ad un livello basso. L&#39;aggiunta di un tipo di cellula che può essere utilizzato come controllo positivo è opportuno garantire che unrisultato negativo non è legata a un problema tecnico e per aiutare con la risoluzione dei problemi. cellule epatiche primarie sono metabolicamente competenti e possono essere utilizzati come controllo, per esempio epatociti primari in sospensione sono molto facile da usare, ma la loro vitalità è limitato nel tempo. Linee di cellule epatiche sono possibili alternative che sono relativamente facili da usare come descritto in questo protocollo, ma alcuni sono migliori di altri in termini di attività metabolica 6, 21. Poiché il saggio è non distruttiva, meno proteine totali è quantificato, è possibile seguire l&#39;attività CYP nel tempo in studi longitudinali 20. Questo è un punto importante perché alcune cellule avranno attività di CYP variabile nel tempo in coltura. Un risultato negativo potrebbe essere associato con la mancanza di confluenza, progresso con la differenziazione o dedifferentiation in vitro. In tal caso, l&#39;approccio è semi-QUANTITATIVAve poiché i dati non è normalizzata dalla quantità totale di proteina in ciascuna coltura cellulare. Non è sempre possibile o consigliabile riutilizzare il tessuto dopo la misurazione dell&#39;attività CYP l&#39;esposizione a sonde, inibitori o induttori possono avere un effetto tossico sul tessuto come avviene per TCDD. frazioni cellulari come microsomi potrebbero anche essere utilizzati per caratterizzare l&#39;attività CYP di un dato tipo di cellula. Microsome preparati, tuttavia, richiedono un sacco di materiale cellulare, l&#39;aggiunta di cofattori adeguate e tampone per assicurare che gli enzimi rimangono attivi. Utilizzando cellule vive elimina la fase di preparazione microsome ingannevole e di lavoro fuori che buffer e cofattori funzionano meglio. Come raccomandazione generale, è una pratica migliore per caratterizzare ulteriormente il profilo di espressione di CYP in colture cellulari per verificare che corrisponda l&#39;attività enzimatica. Questo ulteriore livello di verifica è raccomandato dato che le sonde metaboliche non sono Enticontare specifico per un singolo CYP e dà maggiore fiducia che l&#39;attività metabolica misurata corrisponde l&#39;espressione dell&#39;enzima corrispondente. Poiché CYP sono proteine di membrana sono relativamente difficili da preparare per western blot, quindi RT-PCR è stato l&#39;approccio preferito al profilo questi enzimi 20. È importante notare che questo protocollo descrive un metodo per attività enzimatica assay CYP che rappresenta solo una famiglia di enzimi metabolici, anche se importante. La flessibilità di un approccio spettrometria di massa permette lo sviluppo di metodi di acquisizione di altre trasformazioni metaboliche dei substrati sonda. Tuttavia, coloro che devono essere sviluppati, uno alla volta e ci sono attualmente meno noti sonde specifiche e inibitori selettivi per altre famiglie di enzimi metabolici. Questa distanza deve essere indirizzata a consentire una valutazione completa della competenza metabolica di cellule in vitro sisteSignorina.

Metabolismo xenobiotico è il processo attraverso il quale le sostanze chimiche estranee all&#39;organismo vengono modificati mediante l&#39;aggiunta di gruppi idrofili e coniugati per facilitare il loro escrezione 1. Tipicamente il metabolismo di xenobiotici è un processo in due fasi con la fase I che consiste principalmente di un&#39;ossidazione con l&#39;aggiunta di uno o più gruppi idrossilici 1, 2. Nella fase II, i gruppi ossidrilici sono utilizzati come accettori per un coniugato idrofilo come glucuronide o un solfato porzione 1, 2. Se un gruppo accettore è già presente sulle molecole, la fase di coniugazione può accadere indipendentemente metabolismo Fase I. Ogni reazione è eseguita da un gruppo specifico di enzimi, per esempio, CYP (citocromo P450), che catalizzano l&#39;idrossilazione (figura 1) e dealchilazione di substrati chimici 3. Conjugation è catalizzata da sulfotransferasi, UDP-glicuronosiltransferasi (Figura 1), glutatione-S-transferasi e N-acetiltransferasi 4. Ogni tessuto e organo avranno uno specifico profilo di espressione dell&#39;enzima metabolico, con il fegato esprimere più di queste proteine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di fase I e II metabolismo fase per cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizzare l&#39;7-idrossilazione di cumarina. 7-idrossicumarina è coniugato ad una porzione glucuronide dalla fase II enzimi UGT, con UGT1A6 e UGT1A9 mostra la più alta attività. Comprensione del metabolismo degli xenobiotici è critico nella valutazione della sicurezza dei farmaci e per la valutazione del rischio chimico per due motivi: la cinetica di reazione determineranno quanto tempo un farmaco o chimiche rimarrà nel corpo in forma attiva o inattiva brima di escrezione; e il composto genitore può essere modificato per una specie più reattivo, instabile e tossico da enzimi metabolici. Tali reazioni note anche come &quot;bioactivation&quot; sono per lo più guidati da fase I CYP enzimi ma anche in occasioni rare per fase II coniugazione 5. Sulla base di questo, la capacità di un modello in vitro per prevedere con precisione i rischi associati a un farmaco o una sostanza chimica è fortemente dipendente dalla competenza metabolica del sistema di celle. Linee cellulari derivate da tessuti malati o dalla trasformazione di cellule normali spesso perdono parte se non tutto il profilo metabolico enzima rappresentative del loro tessuto di origine 6. Il mantenimento del normale profilo metabolico enzima appare meglio in colture di cellule primarie (almeno nelle culture breve) ed è ulteriormente migliorata se il tessuto viene coltivato in una matrice permettendo così di mantenere la sua struttura 3D 1. Pertanto, il characterization della competenza metabolica di un sistema cellulare in vitro è un passo preliminare importante nel guidare la decisione su quale modello cellulare è opportuno effettuare valutazioni di sicurezza chimici. In questo articolo presentiamo un protocollo al profilo l&#39;attività e l&#39;espressione degli enzimi CYP Fase I in vitro con esempi della loro applicazione con una linea di cellule epatiche 7 e colture cellulari primarie polmone 3D 8. substrati specifici CYP, loro prodotti metabolici e inibitore controlli sono descritti insieme spectrometry- massa e di quantificazione luminogenic-based. Poiché alcuni CYP sono inducibili e altri sono costitutive, esempi anche essere dati per questi due scenari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

enzimi che metabolizzano xenobiotici svolgono una funzione chiave nella biotrasformazione di farmaci e sostanze tossiche con l&#39;aggiunta di gruppi funzionali che aumentano la solubilità e facilitano l&#39;escrezione. In alcune occasioni quelle modifiche strutturali portano alla formazione di nuovi prodotti tossici. Al fine di ridurre la sperimentazione sugli animali, rischio chimico può essere valutata utilizzando cellule metabolicamente competenti. L&#39;espressione degli enzimi metabolici, tuttavia, non è stabile nel tempo in molti sistemi di coltura primaria in vitro ed è spesso parziale o assente in linee cellulari. Pertanto, lo studio dei farmaci, additivi, e il metabolismo inquinanti ambientali in vitro dovrebbe idealmente essere condotta in sistemi cellulari in cui l&#39;attività metabolica è stata caratterizzata. Spieghiamo qui un approccio per misurare l&#39;attività di una classe di enzimi metabolici (Fase umana I) in linee cellulari 2D e 3D colture primarie utilizzando sonde chimici ed i loro prodotti metabolici quantificabili mediante spettrometria di massa e UPLCluminometria. Il metodo può essere implementato per testare l&#39;attività metabolica in linee cellulari e cellule primarie derivate da una varietà di tessuti.

Esempi di attività metabolica misurati per due coppie di CYP (CYP1A1 / 1B1 e CYP2A6 / 2A13) nelle colture cellulari vie da tre diversi donatori (vie aeree M360, M370, M417) e la linea cellulare epatica (line Hep) sono mostrati in figura 6 20. Attività CYP misurata da luminometria La Figura 6A mostra la luminescenza relativa prodotte dall&#39;attività CYP1A1 / 1B1 O-dealchilazione di Luc-CEE (Luciferin 6&#39;-cloroetil etere) in cellule delle vie aeree (3 donatori) e cellule epatiche con e senza TCDD induzione. CYP1A1 / 1B1 sono enzimi altamente inducibile e sono tipicamente non espresso ad un livello costitutivo nella maggior parte dei tessuti. Come visibile in figura 6A, nessun segnale luminogenic viene rilevata quando le cellule non sono indotte. Quando entrambi i tipi di cellule vengono pre-incubate con TCDD, un forte CYP1A1 / 1B1 induttore, un marchiosegnale ed luminogenic viene rilevato rispetto al controllo (Figura 6A). Ciò indica che la sonda Luc-CEE è stato metabolizzato che porta al rilascio della frazione luciferina che viene quantificata in seguito. Nel complesso l&#39;attività dalla linea cellulare epatico TCDD trattata è inferiore di quella delle cellule delle vie aeree, anche dopo la normalizzazione delle proteine ​​totali. Questo non è insolito in quanto linee cellulari tendono ad essere meno metabolicamente attivo di cellule primarie. Aggiunta di α-naftoflavone ha un chiaro effetto inibitorio sull&#39;attività CYP1A1 / 1B1 in tutti i tipi di cellule che conferma ulteriormente la CYP dipendenza del metabolismo Luc-CEE. La quantificazione di metaboliti CYP450 usando UPLC-MS La Figura 6B illustra la quantificazione di CYP2A6 / 2A13 attività in cellule delle vie aeree da 3 donatori (Airway M343, M345, M347) e le cellule epatiche (linea Hep) dopo incubazione con cumarina in presenza e assenza della INHIBITOR 8-metossipsoralene. I dati sono normalizzati per proteine ​​totali. Nel controllo cumarina incubazione 0 min, senza 7-idrossicumarina viene rilevata (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 sono espressi costitutivamente in alcuni tessuti e quindi dopo 16 h di incubazione con formazione di cumarina 7-idrossicumarina viene rilevata nei diversi tipi cellulari testate, anche senza induzione. Quando 8-psoralene, viene aggiunto un inibitore di CYP2A (figura 6B), la formazione di 7-idrossicumarina è notevolmente ridotta. Va notato che in presenza dell&#39;inibitore CYP, è normale rilevare ancora qualche attività residua come inibizione è raramente completa e poiché altri CYP potrebbe anche essere in grado di riconoscere il substrato ma elaborarlo molto meno efficiente. Si può anche osservare che l&#39;attività metabolica registrato può essere differente tra i donatori utilizzando cellule primarie come è visibile per CYP2A6 in cellule delle vie aeree(Figura 6B). Questo è previsto come l&#39;attività CYP è suscettibile di genotipo e polimorfismi di ciascun donatore. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figura 6: Saggio di attività Risultato per CYP1A1 / 1B1 attività (A) e CYP2A6 / 2A13 attività (B) nella epatica Cell Line e in tre Airway cellulare donatori (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE attività dealchilazione è mostrato con e senza induzione di CYP1A1 / 1B1 da TCDD. α-naftoflavone stato utilizzato come inibitore del CYP1A1 / 1B1. All&#39;attività sono espressi come unità relative luminescenza (RLU) normalizzati dal tempo di incubazione in minuti (min) e proteina totale (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 non richiedono l&#39;induzione come sono espresse costitutivamente. Cumarina attività 7-idrossilazione in proteine ​​pmol / min / mg è indicata a tempi diversi con e senza l&#39;inibitore 8-methoxypsorAlen. Tutti i risultati sono presentati come un valore medio di tre misurazioni indipendenti con deviazioni standard dalla media. Questa figura è stata modificata da Baxter 20. Supplemental Tabella 1: UPLC e impostazioni spettrometro di massa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Competenza metabolica dei sistemi in vitro è un requisito fondamentale per la biotrasformazione e la disposizione di farmaci e sostanze tossiche. In questo protocollo, si descrive l&#39;applicazione di sonde metabolici riferimento per valutare fase del metabolismo in colture cellulari.

Spettrometria di Massa e approcci Luminogenic a base di caratterizzare la fase I metabolica competenza di<em&gt; In Vitro</em&gt; colture cellulari

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...