Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB og EM var ansatte i British American Tobacco på den tiden dette manuskriptet ble skrevet. Arbeidet er beskrevet i dette manuskriptet ble finansiert av British American Tobacco, og publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av British American Tobacco.

For tiden er mange standardiserte toksikologiske testsystemer som bruker konstruerte bakterier, cellelinjer, eller embryonale celler som ikke er representative for den normale humane metabolisme 1. Dette kan føre til unøyaktige prediksjonene av den potensielle toksiske aktivitet av en kjemisk eller medisin. In vitro-modeller, slik som 3D-cellekulturer og organ på en brikke, blir utviklet i et forsøk på å bedre gjenskape normal morfologi og metabolsk aktivitet i humant vev 21, 22, 23. Metabolsk kompetanse er et kriterium som kan brukes til å dechiffrere hvilke modeller som er best egnet for toksikologiske vurdering og narkotika biotransformasjonsprodukter studier. Protokollen har vi beskrevet i denne artikkelen er konstruert for å måle aktiviteten til CYP-enzymer ved hjelp av levende celler. Den er fleksibel og kan brukes til forskjellige cellesystemer i 2D eller 3D cultures og tilbyr muligheten til å bruke enten en luminogenic sonde og eller massespektrometri basert tilnærming. Begge metodene er følsom nok til å detektere nanogram-mengder av stoffer, og bare krever et lite antall celler dyrket i et multibrønnformat. De kan også bli brukt for å, sfæroide eller cellene dyrkes i komplekse matriser. Utvelgelsen av sonden substratet er åpenbart en viktig del av protokollen. Spesifisiteten av analysen er avhengig av proben er selektivt av CYP-enzym og et annet lag av sikkerhet kan oppnås ved anvendelse av en selektiv CYP inhibitor. De substrater og inhibitorer som er oppført i dette papir er bare noen få eksempler, men andre kan bli funnet i litteraturen. Det er viktig å vurdere flere inkubasjonstider når man arbeider med en ny celletype som et negativt resultat CYP aktivitet kan skyldes enzymet som uttrykkes på et lavt nivå. Tilsetningen av en celletype som kan benyttes som en positiv kontroll er tilrådelig for å sikre at ennegativt resultat er ikke knyttet til et teknisk problem, og for å hjelpe med eventuelle feilsøking. Primære leverceller er metabolsk kompetent og kan brukes som kontroll, for eksempel primære hepatocytter i suspensjonen er meget enkelt å bruke, men deres levedyktighet er begrenset i tid. Levercellelinjer er mulige alternativer som er forholdsvis enkle å bruke som er beskrevet i denne protokollen, men noen er bedre enn andre i form av metabolsk aktivitet til 6, 21. Siden analysen er ikke-destruktiv, med mindre total-protein kvantifiseres, er det mulig å følge CYP-aktivitet over tid i longitudinelle studier 20. Dette er et viktig poeng fordi noen celler vil ha variabel CYP aktivitet over tid i kultur. Et negativt resultat kan være forbundet med mangel på konfluens fremskritt med differensiering eller dedifferensiering in vitro. I så fall, er problemstillingen semi-quantitative siden dataene ikke normaliseres av den totale mengden av protein i hver cellekultur. Det er ikke alltid mulig eller anbefalt å gjenbruke vev etter måling av CYP aktivitet som eksponering til prober, hemmere eller induktorer kan ha en toksisk virkning på vev som er tilfellet for TCDD. Cellefraksjoner slik som mikrosomer kan også benyttes for å karakterisere CYP aktiviteten til en gitt celletype. Mikrosomekstrakter preparater krever imidlertid mye av cellemateriale, tilsetning av tilstrekkelig kofaktorer og buffer for å sikre at enzymene som forblir aktiv. Ved hjelp av levende celler eliminerer vanskelig micro forberedelse trinn og arbeider ut hvilke buffere og kofaktorer fungerer best. Som en generell anbefaling, er det en god fremgangsmåte for å karakterisere videre ekspresjonsprofilen av CYPs i cellekulturer for å bekrefte at det samsvarer med enzymatisk aktivitet. Denne ekstra nivå av verifiserings anbefales gitt at de metabolske probene ikke er entiavhengige spesifikke for en enkelt CYP og det gir større tillit til at den målte metabolske aktiviteten er avstemt med det tilsvarende enzym uttrykk. Siden CYPs er membranproteiner de er forholdsvis vanskelig å fremstille for Western blot, derfor kvantitativ RT-PCR har vært den foretrukne metode for å profilere disse enzymer 20. Det er viktig å merke seg at denne protokollen beskriver en metode for å analysere med CYP-enzymaktiviteten som bare representerer en familie av metabolske enzymer, selv om den er viktig. Fleksibiliteten av en massespektrometri løsning tillater utvikling av innsamlingsmetode for andre metabolske transformasjoner av prøvesubstrater. Men de har til å bli utviklet en om gangen, og det er for tiden færre kjente spesifikke prober og selektive inhibitorer for andre metabolske enzymfamilier. Dette gap bør tas opp for å tillate en fullstendig vurdering av den metabolske kompetansen av in vitro celle systems.

Xenobiotisk metabolisme er den prosessen som kjemikalier som er fremmede for legemet blir modifisert ved tilsetning av hydrofile grupper og konjugater for å lette deres utskillelse 1. Typisk metabolismen av xenobiotika er en to-trinns prosess med fase I som består hovedsakelig av en oksydasjon med tillegg av en eller flere hydroksylgrupper 1, 2. I fase II, blir hydroksylgruppene brukt som akseptorer for en hydrofil konjugat slik som glukuronid eller en sulfatgruppe 1, 2. Dersom en akseptor-gruppen allerede er tilstede i molekylene, kan det konjugeringstrinn skje uavhengig av fase I metabolisme. Hver reaksjon blir utført ved hjelp av en spesifikk gruppe enzymer, for eksempel, CYPs (cytokrom P450&#39;er), som katalyserer hydroksylering (figur 1) og dealkylering av kjemiske substrater 3. Conjugation blir katalysert av sulfotransferaser, UDP-glukuronosyltransferaser (figur 1), glutation-S-transferaser og N-acetyltransferases 4. Hvert vev og organ vil ha en bestemt metabolsk enzym ekspresjonsprofilen, med leveren for å uttrykke de fleste av disse proteiner. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figur 1: Eksempel på fase I og fase II Metabolism til Coumarin. CYP2A6 / CYP2A13 katalysere 7-hydroksylering av kumarin. 7-hydroxykumarin er konjugert til en glukuronid resten ved fase II-enzymer UGTs, med UGT1A6 og UGT1A9 som viser den høyeste aktivitet. Forståelse metabolismen av xenobiotika er kritisk i evalueringen av narkotika sikkerhet og for kjemisk risikovurdering av to grunner: reaksjonskinetikkene vil bestemme hvor lenge et medikament eller kjemiske vil forbli i kroppen i en aktiv eller inaktiv form before utskillelse; og stamforbindelsen kan modifiseres til en mer reaktiv, ustabil og toksiske art av metabolske enzymer. Slike reaksjoner også kjent som &quot;bioaktivering&quot; er for det meste drevet av fase I-CYP-enzymer, men også på mer sjeldne anledninger av fase II konjugering 5. Basert på dette ble evnen til en in vitro modell for å forutsi risikoen forbundet med et medikament eller et kjemisk er svært avhengig av den metabolske kompetansen av cellesystemet. Cellelinjer avledet fra syke vev eller fra transformasjonen av normale celler ofte miste en del om ikke alle av de metabolske enzym profilen er representative for deres vev opprinnelses 6. Opprettholdelsen av den normale metabolske enzym profil vises bedre i primære cellekulturer (i det minste i korte tidskulturer) og blir ytterligere forbedret dersom vevet er dyrket i en matrise slik at den beholder sin 3D-struktur en. Derfor røyeacterization av metabolsk kompetansen av et in vitro cellesystem er et viktig innledende trinn i styring av beslutningen om hvilken cellemodell er hensiktsmessig å gjennomføre kjemiske sikkerhetsvurderinger. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å profilere aktivitet og ekspresjon av fase I CYP-enzymer in vitro med eksempler på deres anvendelse med en levercellelinje 7 og 3D primær lungecellekulturer 8. CYP spesifikke substrater, deres metabolske produkter og inhibitor kontroll er beskrevet sammen med massen spectrometry- og luminogenic-baserte kvantifisering metoder. Siden noen CYPs er induserbar og andre er konstituerende, vil eksempler også bli gitt for de to scenariene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

Xenobiotiske metaboliserende enzymer spiller en nøkkelfunksjon i biotransformasjonen av medisiner og giftstoffer ved tilsetning av funksjonelle grupper som øker oppløseligheten og letter utskillelsen. I noen tilfeller er disse strukturelle endringer føre til dannelse av nye giftige produkter. For å redusere dyreforsøk, kan kjemisk risiko vurderes ved hjelp av metabolsk kompetente celler. Ekspresjon av metabolske enzymer, men er ikke stabil over tid i mange in vitro-primærkultursystemer og er ofte delvis eller fraværende i cellelinjer. Derfor bør studiet av legemidler, additiver, og miljøgifter metabolisme in vitro ideelt sett være utført i cellesystemer hvor stoffskifteaktivitet er blitt karakterisert. Vi forklarer her en metode for å måle aktiviteten til en klasse av metabolske enzymer (human fase I) i 2D-cellelinjer og primære 3D-kulturer ved anvendelse av kjemiske sonder og deres metabolske produkter kvantifiserbare ved UPLC massespektrometri ogluminometry. Fremgangsmåten kan implementeres for å teste den metabolske aktiviteten i cellelinjer og primære celler avledet fra en rekke forskjellige vev.

Eksempler på metabolsk aktivitet som er målt for to par CYPs (CYP1A1 / 1B1 og CYP2A6 / 2A13) i luftveiene cellekulturer fra tre forskjellige donorer (luftveis M360, M370, M417) og hepatisk cellelinje (Hep linje) er vist i figur 6 20. CYP-aktivitet målt ved luminometry Figur 6A viser den relative luminescens som frembringes av CYP1A1 / 1B1 O-dealkylering aktiviteten til Luc-CEE (Luciferin 6&#39;-kloretyleter) i luftveisceller (3 donorer) og hepatiske celler med og uten TCDD induksjon. CYP1A1 / 1B1 er meget induserbare enzymer, og er vanligvis ikke uttrykkes på et nivå konstitutivt i de fleste vev. Som det kan ses i figur 6A, er ingen luminogenic signal som detekteres når cellene ikke blir indusert. Ved begge celletyper er pre-inkubert med TCDD, en sterk CYP1A1 / 1B1 inducer, et merkeed luminogenic signal blir detektert sammenlignet med kontroll (figur 6A). Dette indikerer at den Luc-CEE-probe er blitt metabolisert som fører til frigivelse av luciferin-gruppen som er kvantifisert etterfølgende. Samlet aktivitet fra TCDD-behandlede levercellelinje som er lavere enn for luftveisceller, selv etter at totalt protein normalisering. Det er ikke uvanlig ettersom cellelinjer har en tendens til å være mindre metabolsk aktiv enn primære celler. Tilsetning av α-naphthoflavone har en klar hemmende virkning på CYP1A1 / 1B1-aktivitet i alle celletyper som ytterligere bekrefter den CYP-avhengighet av Luc-CEE metabolisme. Kvantifisering av CYP450 metabolitter ved hjelp av UPLC-MS Figur 6B illustrerer kvantifisering av CYP2A6 / 2A13 aktivitet i luftveisceller fra 3 donorer (Airway M343, M345, M347) og leverceller (Hep linje) etter inkubering med kumarin i nærvær og fravær av inhibitor 8-metoksypsoralen. Dataene er normalisert til total-protein. I 0 min kumarin inkubering kontroll, ingen 7-hydroxykumarin detektert (Figur 6B). CYP2A6 / 2A13 er uttrykt konstitutivt i visse vev, og derfor etter 16 timers inkubering med kumarin dannelse av 7-hydroxykumarin påvises i de forskjellige celletypene som ble testet, selv uten induksjon. Når 8-metoksypsoralen, er en CYP2A tilsatt inhibitor (figur 6B), er dannelse av 7-hydroxykumarin betydelig redusert. Det skal bemerkes at i nærvær av CYP-inhibitor, er det vanlig å detektere fremdeles en viss restaktivitet som hemning er sjelden fullstendig og siden andre CYPs kan også være i stand til å gjenkjenne den substratet, men behandle den langt mindre effektivt. Det kan også observeres at den registrerte metabolsk aktivitet kan være forskjellig mellom givere ved bruk av primære celler som det er synlig for CYP2A6 i luftveisceller(Figur 6B). Dette er forventet som CYP aktivitet er ansvarlig for hver donor genotype og polymorfismer. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figur 6: Aktivitet assay-resultatet for CYP1A1 / 1B1 aktivitet (A) og CYP2A6 / 2A13 aktivitet (B) i den levercellelinje og i tre Airway Cell donorer (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE dealkylering aktivitet er vist med og uten induksjon av CYP1A1 / 1B1 av TCDD. α-naphthoflavone ble anvendt som CYP1A1 / 1B1-inhibitor. Aktiviteten er uttrykt som relative luminescens-enheter (RLU) normalisert ved inkubering tiden i minutter (min) og samlet protein (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 ikke krever induksjon som de er uttrykt konstitutivt. Kumarin-7-hydroksylering aktivitet i pmol / min / mg protein, er vist ved forskjellige tidspunkter med og uten inhibitor 8-methoxypsorAlen. Alle resultater er presentert som middelverdi av tre uavhengige målinger med standardavvik av gjennomsnittet. Dette tallet ble endret fra Baxter 20. Supplerende Tabell 1: UPLC og massespektrometer Innstillinger. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Metabolsk kompetansen av in vitro-systemer er en viktig forutsetning for biotransformasjonen og disponering av narkotika og giftstoffer. I denne protokollen beskriver vi anvendelse av referanse metabolske prober for å vurdere fase I metabolisme i cellekulturer.

Massespektrometri og Luminogenic baserte tilnærminger for å karakter Fase I Metabolsk kompetansen<em&gt; In Vitro</em&gt; Cell Cultures

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillær elektroforese-massespektrometri for Metabolsk profilering av biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...