Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB и EM были сотрудники British American Tobacco в то время эта рукопись была написана. Работа, описанная в этой рукописи финансировался British American Tobacco и публикации плата за это видео-статьи были оплачены British American Tobacco.

В настоящее время многие стандартные токсикологические испытания системы используют Engineered бактерии, клеточные линии, или эмбриональные клетки, которые не представляют нормального метаболизма человека 1. Это может привести к неточным прогнозам потенциальной токсической активности химических или медицины. Новаторский в моделях пробирки, такие как клеточные культуры и 3D орган на чипе, в настоящее время разрабатываются в попытке лучше повторить нормальную морфологию и метаболическую активность тканей человека 21, 22, 23. Метаболический компетенция один критерий, который может быть использован, чтобы расшифровать, какие модели лучше всего подходит для оценки и биотрансформации наркотиков исследований токсикологических. Протокол мы изложили в этой статье, предназначен для измерения активности ферментов CYP с использованием живых клеток. Он гибок и может быть использован для различных клеточных систем в 2D или 3D КУЛЬТУРЕх года, и предлагает возможность использовать либо люминогенный зондовый или массовый подход спектрометрии на основе. Оба метода достаточно чувствительны, чтобы обнаружить нанограммовые количества материалов и требуют лишь небольшого числа клеток, выращенных в многоямного формате. Они также могут быть применены к сфероида или клетки, выращенные в комплексных матриц. Выбор подложки зонда, очевидно, является важным элементом протокола. Специфичность анализа опирается на зонде избирательности от CYP фермента и другого слоя обеспечения может быть получен путем использования селективного ингибитора CYP. Субстраты и ингибиторы, перечисленные в настоящем документе, являются всего лишь несколько примеров, но другие могут быть найдены в литературе. Это важно учитывать несколько раз инкубации при работе с новым типом клеток в результате отрицательного CYP активности может быть связано с ферментом выражается на низком уровне. Добавление типа клеток, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля желательно, чтобы гарантировать, чтоОтрицательный результат не связан с технической проблемой и помочь с любым устранением неполадок. Первичные клетки печени метаболически компетентным и могут быть использованы в качестве контроля, например, первичные гепатоциты в суспензии очень просты в использовании, но их жизнеспособность ограничена во времени. Печеночные клеточные линии являются возможными альтернативами , которые относительно просты в использовании , как описаны в данном протоколе, но некоторые из них лучше , чем другие с точкой зрения метаболической активности 6, 21. Поскольку анализ является неразрушающим, если общий белок не количественно, то можно следить за CYP активности с течением времени в продольных исследованиях 20. Это очень важный момент, потому что некоторые клетки имеют различную активность CYP с течением времени в культуре. Отрицательный результат может быть связан с отсутствием сплошности, прогресс с дифференциацией или дифференцировке в пробирке. В этом случае подход является полу-quantitatiве, поскольку данные не нормированы на общее количество белка в каждой культуре клеток. Это не всегда возможно или рекомендуется повторно использовать ткань после измерения CYP активности в качестве зондов воздействия, ингибиторы или индукторов может оказывать токсическое воздействие на ткани, как это имеет место для ТХДДА. Клеточные фракции, такие как микросомы могут также использоваться, чтобы характеризовать CYP активность данного типа клеток. Микросом препараты, однако, требуют много клеточного материала, добавление адекватных кофакторов и буфера, чтобы гарантировать, что ферменты остаются активными. Использование живых клеток устраняет хитрый шаг подготовки микроса и разработка которых буфера и кофакторы работают лучше всего. В качестве общей рекомендации, это лучшая практика для дальнейшей характеристики профиля экспрессии CYPs в клеточных культурах, чтобы убедиться, что она соответствует ферментативной активности. Этот дополнительный уровень верификации рекомендуется, учитывая, что метаболические зонды не энтитеполагается специфичным для одного CYP, и это дает повышенную уверенность в том, что измеренная метаболической активность подобрано соответствующее выражение фермента. Так как CYPs являются мембранные белки , они относительно трудно приготовить для вестерн - блотов, поэтому количественный ОТ-ПЦР была предпочтительным подходом к профилю этих ферментов 20. Важно отметить, что этот протокол описан способ для анализа активности фермента CYP, который представляет только одно семейство ферментов метаболизма, хотя и важная. Гибкость спектрометрического подхода масс позволяет разработку методов приобретения для других метаболических превращений зондовых субстратов. Тем не менее, те, которые должны быть разработаны по одному за раз, и в настоящее время имеется меньше известные специфические зонды и селективные ингибиторы для других метаболических ферментов семей. Этот пробел следует решать , чтобы обеспечить комплексную оценку метаболической компетентности в пробирке клетки противовирусныхМиз.

Ксенобиотиков метаболизм является процессом , посредством которого химические вещества , чуждые тела изменены путем добавления гидрофильных групп и конъюгатов для облегчения их экскреции 1. Как правило , метаболизм ксенобиотиков является двухстадийный процесс с этапа I , состоящей в основном из окисления с добавлением одного или нескольких гидроксильных групп 1, 2. В фазе II, гидроксильные группы, используются в качестве акцепторов для гидрофильного конъюгата , таких как глюкурониды или сульфат фрагмент 1, 2. Если акцептор группа уже присутствует на молекулах, стадия конъюгации может происходить независимо от стадии I метаболизма. Каждая реакция осуществляют с помощью определенной группы ферментов, например, CYPs (цитохром Р450), которые катализируют гидроксилирование (рисунок 1) и деалкилирования химических субстратов 3. Conjugatioп катализируется sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases (Фигура 1), глутатион-S-трансферазы и N-ацетилтрансферазы 4. Каждые ткани и органы будут иметь специфический метаболический профиль экспрессии фермента, с печенью, выражающим большинством из этих белков. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Рисунок 1: Пример фаза I и фаза II метаболизма для кумарина. CYP2A6 / CYP2A13 катализировать 7-гидроксилирование кумарина. 7-гидроксикумарин конъюгирован с фрагментом глюкуронид с помощью фазы II ферментов ЕСГА с UGT1A6 и UGT1A9 показывают самую высокую активность. Понимание метаболизма ксенобиотиков имеет решающее значение в оценке безопасности лекарственных средств и для оценки химического риска по двум причинам: кинетика реакции будет определять, как долго препарат или химическое вещество остается в организме в активной или неактивной форме бEfore экскреции; и исходное соединение может быть модифицировано для более реактивных, нестабильных и токсичных видов метаболических ферментов. Такие реакции , также известные как «биоактивация» в основном обусловлены фазой I CYP ферменты , но и на более редких случаях с помощью фазы II конъюгации 5. Исходя из этого, способность модели ин витро точно предсказать риск , связанный с лекарственным средством или химическим веществом , сильно зависит от метаболической компетенции клеточной системы. Клеточные линии , полученные из пораженных тканей или из трансформации нормальных клеток часто теряют часть , если не все из метаболического профиля фермента представителя их ткани происхождения 6. Поддержание нормального метаболического профиля фермента появляется лучше в первичных клеточных культурах (по крайней мере в краткосрочных культурах) и дополнительно улучшается , если ткань культивирует в матрице , что позволяет ему сохранить свою 3D структуру 1. Таким образом, символтеристика метаболической компетентности системы клеток в пробирке является важным предварительным шагом в руководстве решения о том, каких моделях клеток целесообразны проводить химические оценки безопасности. В данной работе мы приводим протокол к профилю активности и экспрессии Фаза I CYP ферментов в пробирке с примерами их применения с печеночной клеточной линии 7 и 3D культур клеток первичной легочной 8. CYP специфические субстраты, их продукты метаболизма и ингибитор управление описано наряду с массовым spectrometry- и методами количественной оценки люминогенной основой. Поскольку некоторые CYPs индуцируется и другие конститутивные, примеры также будут приведены для этих двух сценариев.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

Ксенобиотические метаболизируя ферменты играют ключевую роль в биотрансформации лекарственных средств и токсиканты путем добавления функциональных групп, которые увеличивают растворимость и облегчают выведение. В некоторых случаях эти структурные модификации приводят к образованию новых токсичных продуктов. Для того, чтобы уменьшить испытания на животное, химические риски могут быть оценены с помощью метаболический компетентных клеток. Экспрессия метаболических ферментов, однако, не является стабильной в течение долгого времени во многих системах в пробирке первичной культуры и часто частичный или отсутствуют в клеточных линиях. Таким образом, изучение лекарственных средств, добавок и загрязнители окружающей среды метаболизма в пробирке в идеале должно быть проведено в клеточных системах , где метаболическая активность была охарактеризована. Пояснит здесь подход для измерения активности класса ферментов метаболизма (Human Phase I) в клеточных линиях 2D и 3D первичных культурах с использованием химических зондов и их продуктов метаболизма количественных с помощью масс-спектрометрии UPLC иluminometry. Способ может быть реализован, чтобы проверить метаболическую активность в клеточных линий и первичных клеток, полученных из различных тканей.

Примеры метаболической активности , измеренные для двух пар CYPs (CYP1A1 / 1B1 и CYP2A6 / 2A13) в культурах дыхательных путей клеток от трех различных доноров (дыхательные пути M360, M370, M417) и печеночной клеточной линии (Нер линии) показаны на рисунке- 20. CYP активность , измеренная с помощью luminometry На фиг.6О показано относительное свечение производимого CYP1A1 / 1B1 О-деалкилирование активности Luc-CEE (Люциферин 6&#39;-хлорэтил) эфир в клетках дыхательных путей (3) и доноров клетки печени с и без ТХДДА индукции. CYP1A1 / 1B1 являются весьма индуцируемые ферменты, и, как правило, не выражены на конститутивной уровне в большинстве тканей. Как можно видеть на фиг.6Ы, не люминогенный сигнал не обнаружен , когда клетка не индуцируется. Когда оба типа клеток предварительно инкубируют с ТХДД, сильным CYP1A1 / 1B1 индуктора, знакСигнал Ed люминогенных обнаруживается по сравнению с контролем (фиг 6А). Это указывает на то, что зонд-Люк СЕЕ был усвоен ведущий к освобождению от люциферин остатка, который затем количественно. В целом деятельность от ТХДДА обработанной линии клеток печени ниже, чем для клеток дыхательных путей, даже после полной нормализации белка. Это не является необычным, так как клеточные линии, как правило, менее метаболически активны, чем первичные клетки. Добавление альфа-naphthoflavone имеет четкий ингибирующий эффект на CYP1A1 / 1B1 активности во всех типах клеток, которые еще раз подтверждают CYP-зависимость метаболизма Люк-CEE. Количественное CYP450 метаболитов с использованием UPLC-MS На фиг.6В показано количественное определение CYP2A6 / 2A13 активности в клетках дыхательных путей от 3 доноров ( в дыхательных путях M343, M345, M347) и печеночных клеток (Нер линия) после инкубации с кумарина в присутствии и в отсутствие inhibitor 8-метоксипсорален. Данные нормализованы на общие белка. В контроле кумарин инкубационного 0 мин, нет 7-гидроксикумарина не обнаружено (фиг.). CYP2A6 / 2A13 выражены конститутивен в некоторых тканях и, следовательно, после 16 ч инкубации с образованием кумарина 7-гидроксикумарина обнаруживается в различных типах клеток, испытанных, даже без индукции. Когда 8-метоксипсорально, ингибитор CYP2A добавляется (фиг.), образование 7-гидроксикумарина значительно снижаются. Следует отметить, что в присутствии ингибитора CYP, это нормально, все еще обнаруживают некоторую остаточную активность, как ингибирование является полным и редко, так как другие CYPs могут также быть в состоянии распознавать субстрат, но обрабатывать его гораздо менее эффективно. Кроме того, можно наблюдать, что записанная метаболическая активность может отличаться от доноров при использовании первичных клеток, как это видно на CYP2A6 в клетках дыхательных путей(Фиг.6В). Ожидается, что это, как активность CYP подлежит генотипа и полиморфизмов каждого донора. <img alt="Рисунок 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Рисунок 6: Анализ активности Результат для CYP1A1 / 1B1 активность (А) и CYP2A6 / 2A13 активности (В) в линии клеток печени , и в трех дыхательных путях клеток доноров (M360, M370, M417). (А) Люк-CEE деалкилирования активность проявляется и без индукции CYP1A1 / 1B1 ТГЖД. α-naphthoflavone был использован в качестве ингибитора CYP1A1 / 1B1. Активность выражают в виде относительных единицах люминесценции (RLU), нормированных по времени инкубации в течение нескольких минут (мин) и общего белка (мг). (B) CYP2A6 / 2A13 не требуют индукции , как они выражаются конститутивно. Кумарин 7-гидроксилирование активность в пмоль / мин / мг белка показана в различные моменты времени с и без ингибитора 8-methoxypsorAlen. Все результаты представлены в виде среднего значения трех независимых измерений с использованием стандартных отклонений от среднего. Эта цифра была изменена от Baxter 20. Справочная таблица 1: UPLC и массовые параметры спектрометров. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">чтобы скачать этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Метаболическая правомочность систем в пробирке является ключевым требованием для биотрансформации и утилизации наркотиков и токсикантов. В этом протоколе мы опишем применение эталонных метаболических зондов для оценки фазы I метаболизма в клеточных культурах.

Масс-спектрометрия и люминогенные подходы, основанные на Охарактеризуйте Фазу I метаболических компетентности в<em&gt; In Vitro</em&gt; Клеточные культуры

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...