Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
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The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. 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AB y EM eran empleados de British American Tobacco en el momento en este manuscrito fue escrito. El trabajo descrito en este manuscrito fue financiada por la British American Tobacco, y las tasas de publicación de este video-artículo fueron pagados por British American Tobacco.

Actualmente, muchos sistemas de prueba toxicológicos normalizados utilizan bacterias modificadas, líneas celulares, o células embrionarias que no son representativos del metabolismo humano normal 1. Esto puede conducir a predicciones inexactas de la potencial actividad tóxica de un producto químico o la medicina. Innovative en modelos in vitro, tales como cultivos de células en 3D y de órganos en un chip, están siendo desarrollados en un intento de replicar mejor la morfología normal y la actividad metabólica de los tejidos humanos 21, 22, 23. competencia metabólica es un criterio que se puede utilizar para descifrar qué modelos son los más adecuados para los estudios de evaluación y de biotransformación de fármacos toxicológicos. El protocolo que hemos descrito en este documento está diseñado para medir la actividad de las enzimas CYP utilizando células vivas. Es flexible y se puede utilizar para diferentes sistemas de células en 2D o 3D culturES y ofrece la opción de utilizar un probe- luminogénico o un enfoque basado en la espectrometría de masas. Ambos métodos son lo suficientemente sensibles para detectar cantidades de nanogramos de materiales y sólo requiere un pequeño número de células cultivadas en un formato de múltiples pocillos. También se pueden aplicar a esferoide o células cultivadas en matrices complejas. La selección del sustrato sonda es, obviamente, un elemento crítico del protocolo. La especificidad del ensayo se basa en la sonda de ser selectivos de la enzima CYP y otra capa de aseguramiento puede ser obtenido por el uso de un inhibidor CYP selectiva. Los sustratos e inhibidores mencionados en este documento son sólo algunos ejemplos, pero otros se pueden encontrar en la literatura. Es importante tener en cuenta varios tiempos de incubación cuando se trabaja con un nuevo tipo de célula como resultado actividad de CYP negativo podría ser debido a la enzima que se expresa en un nivel bajo. La adición de un tipo de célula que se puede utilizar como un control positivo es aconsejable para garantizar que unaresultado negativo no está vinculado a un problema técnico y para ayudar con cualquier solución de problemas. células hepáticas primarias son metabólicamente competente y se pueden usar como control, para los hepatocitos primarios ejemplo en suspensión son muy fáciles de usar, pero su viabilidad es limitada en el tiempo. Líneas de células hepáticas son posibles alternativas que son relativamente fáciles de usar como se describe en este protocolo, pero algunos son mejores que otros en términos de actividad metabólica 6, 21. Dado que el ensayo es no destructivo, a menos que la proteína total se cuantifica, es posible seguir la actividad de CYP en el tiempo en los estudios longitudinales 20. Este es un punto importante porque algunas células tendrán una actividad CYP variable en el tiempo en cultivo. Un resultado negativo podría estar asociado con la falta de confluencia, el progreso con la diferenciación o desdiferenciación in vitro. En ese caso, el enfoque es semi-quantitative ya que los datos no se normaliza por la cantidad total de proteína en cada cultivo celular. No siempre es posible o recomendado para reutilizar el tejido después de la medición de la actividad de CYP como la exposición a sondas, inhibidores o inductores puede tener un efecto tóxico en el tejido como es el caso para la TCDD. fracciones de células tales como microsomas también podrían usarse para caracterizar la actividad de CYP de un tipo celular dado. De microsomas preparados, sin embargo, requieren una gran cantidad de material celular, la adición de cofactores adecuados y tampón para asegurar que las enzimas se mantienen activas. El uso de células vivas elimina la etapa de preparación de microsomas complicado y la elaboración de los cuales tampones y cofactores que mejor funcionan. Como recomendación general, es una buena práctica para caracterizar mejor el perfil de expresión de APP en cultivos de células para verificar que coincida con la actividad enzimática. Este nivel adicional de verificación se recomienda dado que las sondas metabólicas no se entidependen específicos de un solo CYP y le da una mayor confianza de que la actividad metabólica medida se corresponde con la expresión de la enzima correspondiente. Desde APP son proteínas de membrana que son relativamente difíciles de preparar para transferencias de Western, por lo tanto, RT-PCR cuantitativa ha sido el enfoque preferido para perfilar estas enzimas 20. Es importante señalar que este protocolo describe un método para la actividad enzimática CYP ensayo que sólo representa una familia de enzimas metabólicas, aunque importante. La flexibilidad de un enfoque de espectrometría de masas permite el desarrollo de métodos de adquisición de otras transformaciones metabólicas de los sustratos de investigación. Sin embargo, aquellos que se han desarrollado uno a la vez y actualmente hay un menor número de sondas específicas conocidas e inhibidores selectivos para otras familias de enzimas metabólicas. Esta brecha debe ser dirigida a permitir una evaluación completa de la capacidad metabólica de las células in vitro en systeSra.

Metabolismo de xenobióticos es el proceso a través del cual las sustancias químicas extrañas al organismo son modificados por la adición de grupos hidrófilos y conjugados para facilitar su excreción 1. Típicamente, el metabolismo de xenobióticos es un proceso de dos pasos con la Fase I consiste principalmente de una oxidación con la adición de uno o múltiples grupos hidroxilo 1, 2. En la Fase II, los grupos hidroxilo se utilizan como aceptores para un conjugado hidrófilo tal como glucurónido o un resto sulfato de 1, 2. Si un grupo aceptor ya está presente en las moléculas, la etapa de conjugación puede ocurrir independientemente del metabolismo de fase I. Cada reacción se lleva a cabo por un grupo específico de enzimas, por ejemplo, APP (citocromos P450), que catalizan la hidroxilación (Figura 1) y desalquilación de sustratos químicos 3. Conjugation es catalizada por sulfotransferasas, UDP-glucuronosiltransferasas (Figura 1), glutatión-S-transferasas y N-acetiltransferasas 4. Cada tejido y órgano tendrán un perfil específico expresión de la enzima metabólica, con el hígado que expresan la mayoría de esas proteínas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de Fase I y Fase II Metabolismo de cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizar la 7-hidroxilación de cumarina. 7-hidroxicumarina se conjuga con un resto glucurónido por enzimas de fase II UGTs, con UGT1A6 y UGT1A9 que muestra la actividad más alta. La comprensión del metabolismo de xenobióticos es fundamental en la evaluación de seguridad de los medicamentos y para la evaluación de riesgo químico por dos razones: la cinética de reacción se determinará cuánto tiempo un fármaco o producto químico permanecerán en el cuerpo en una forma activa o inactiva bexcreción ntes; y el compuesto de origen se puede modificar para una especie más reactiva, inestable y tóxico por las enzimas metabólicas. Tales reacciones también conocidos como &quot;bioactivación&quot; son impulsados en su mayoría por la fase I CYP enzimas, sino también en ocasiones más raras de fase II conjugación 5. Basado en esto, la capacidad de un modelo in vitro para predecir con precisión el riesgo asociado con un fármaco o una sustancia química depende de la competencia metabólica del sistema celular altamente. Las líneas celulares derivadas de tejidos enfermos o de transformación de células normales a menudo pierden parte si no la totalidad del perfil de enzima metabólica representante de su tejido de origen 6. El mantenimiento del perfil de la enzima metabólica normal aparece mejor en cultivos celulares primarios (al menos en cultivos de corto plazo) y se mejora aún más si el tejido se cultiva en una matriz que le permite conservar su estructura 3D 1. Por lo tanto, el carbón de leñaacterization de la competencia metabólica de un sistema de células in vitro es un paso preliminar importante en la orientación de la decisión sobre qué modelo de células es apropiado para llevar a cabo evaluaciones de seguridad química. En este documento se presenta un protocolo para el perfil de la actividad y expresión de enzimas de fase I CYP in vitro con ejemplos de su aplicación con una línea celular hepática 7 y cultivos celulares primarios de pulmón 3D 8. sustratos específicos de CYP, sus productos metabólicos y el inhibidor de controles se describen junto con spectrometry- de masas y métodos de cuantificación basados ​​en luminógeno. Dado que algunos APP son inducibles y otros son constitutivos, también se dan ejemplos para los dos escenarios.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

enzimas que metabolizan xenobióticos desempeñan una función clave en la biotransformación de los medicamentos y sustancias tóxicas mediante la adición de grupos funcionales que aumentan la solubilidad y facilitan la excreción. En algunas ocasiones, estas modificaciones estructurales conducen a la formación de nuevos productos tóxicos. A fin de reducir los ensayos con animales, riesgo químico puede evaluarse utilizando células metabólicamente competentes. La expresión de enzimas metabólicas, sin embargo, no es estable con el tiempo en muchos en sistemas de cultivo primario in vitro y es a menudo parcial o ausente en líneas celulares. Por lo tanto, el estudio de medicamentos, aditivos, y el metabolismo de los contaminantes ambientales en vitro idealmente debe llevarse a cabo en sistemas de células en donde la actividad metabólica se ha caracterizado. A continuación explicamos un método para medir la actividad de una clase de enzimas metabólicas (fase I en humanos) en líneas celulares en 2D y 3D culturas primarias usando sondas químicas y sus productos metabólicos cuantificables mediante espectrometría de masas y UPLCluminometrıa. El método puede ser implementado para probar la actividad metabólica en líneas celulares y células primarias derivadas de una variedad de tejidos.

Ejemplos de actividad metabólica medidos para dos pares de CYP (CYP1A1 / 1B1 y CYP2A6 / 2A13) en los cultivos de células de las vías respiratorias de tres donantes diferentes (las vías respiratorias M360, M370, M417) y la línea celular hepática (línea Hep) se muestran en la Figura 6 20. Actividad CYP medida por luminometría La Figura 6A muestra la luminiscencia relativa producida por la actividad de CYP1A1 / 1B1 O-desalquilación de Luc-CEE (luciferina 6&#39;-cloroetil éter) en las células de las vías respiratorias (3 donantes) y las células hepáticas con y sin inducción de TCDD. CYP1A1 / 1B1 son enzimas altamente inducible y normalmente no se expresa a un nivel constitutiva en la mayoría de tejidos. Como puede verse en la Figura 6A, no se detecta señal luminógeno cuando no se inducen las células. Cuando ambos tipos de células se pre-incubaron con TCDD, un fuerte CYP1A1 / 1B1 inductor, una marcase detecta la señal ed luminógeno comparación con el control (Figura 6A). Esto indica que la sonda Luc-CEE ha sido metabolizado conduce a la liberación de la fracción de la luciferina que se cuantifica posteriormente. En general, la actividad de la línea celular hepática TCDD tratada es inferior a la de las células de las vías respiratorias, incluso después de la normalización de proteína total. Esto no es inusual puesto que las líneas de células tienden a ser menos activa metabólicamente que las células primarias. La adición de α-naftoflavona tiene un claro efecto inhibidor sobre la actividad de CYP1A1 / 1B1 en todos los tipos celulares que confirma aún más la CYP-dependencia del metabolismo Luc-CEE. La cuantificación de los metabolitos del CYP450 usando UPLC-MS La Figura 6B ilustra la cuantificación de CYP2A6 actividad / 2A13 en las células de las vías respiratorias a partir de 3 donantes (Airway M343, M345, M347) y las células hepáticas (línea Hep) después de la incubación con cumarina en presencia y ausencia del INHIbitor 8-metoxipsoraleno. Los datos se normalizaron para la proteína total. En el control de cumarina de incubación 0 min, no 7-hidroxicumarina se detecta (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 se expresan constitutivamente en ciertos tejidos y, por tanto, después de 16 h de incubación con la formación de cumarina de 7-hidroxicumarina se detecta en los diferentes tipos de células ensayadas, incluso sin inducción. Cuando 8-metoxipsoraleno, se añade un inhibidor CYP2A (Figura 6B), la formación de 7-hidroxicumarina se reduce considerablemente. Cabe señalar que, en presencia del inhibidor de CYP, es normal que todavía detectar alguna actividad residual como la inhibición rara vez es completa y ya que otros APP también puede ser capaz de reconocer el sustrato pero procesarlo mucho menos eficiente. También se puede observar que la actividad metabólica grabado puede ser diferente entre los donantes utilizando las células primarias, ya que es visible para el CYP2A6 en células de las vías respiratorias(Figura 6B). Se espera que la actividad del CYP es susceptible de genotipo y polimorfismos de cada donante. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figura 6: Ensayo de actividad de Resultado para CYP1A1 / 1B1 Actividad (A) y CYP2A6 / 2A13 actividad (B) en la línea celular hepática y en tres Airway Cell donantes (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE actividad desalquilación se muestra con y sin inducción de CYP1A1 / 1B1 por TCDD. α-naftoflavona fue utilizado como inhibidor de CYP1A1 / 1B1. La actividad se expresa como unidades relativas de luminiscencia (RLU) normalizados por el tiempo de incubación en minutos (min) y proteína total (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 no requieren inducción, ya que se expresan de forma constitutiva. La cumarina actividad 7-hidroxilación en las proteínas pmol / min / mg se muestra en diferentes puntos de tiempo con y sin el inhibidor de 8-methoxypsoralen. Todos los resultados se presentan como un valor medio de tres mediciones independientes con desviaciones estándar de la media. Esta cifra se modificó a partir Baxter 20. Suplementario Tabla 1: UPLC y ajustes del espectrómetro de masas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultivos Celulares

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

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