Name: mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.

<ol>
	<li>Garcia-Canton, C., Minet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Characterization+of+Cell+Systems+Used+in+In+Vitro+Toxicology+Testing.">Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing.</a> Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).</li><li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments.">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li><li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=57+varieties:+the+human+cytochromes+P450.">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li><li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+drug+metabolizing+enzymes.">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, 103-116 (2010).</li><li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity.">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li><li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies.">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li><li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatoma+HepaRG+cells:+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics.">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li><li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+(MucilAir)+to+assess+respiratory+sensitizers.">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li><li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency.">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li><li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke.">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li><li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes.">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li><li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2.">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li><li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes.">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li><li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism:+substrates+and+inhibitors+in+vitro,+in+vivo+and+in+silico.">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li><li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes.">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li><li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1.">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li><li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism:+a+clinical+probe+for+P450+2E1.">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li><li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver,+Helix+pomatia,+and+E.+coli.">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li><li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+omics+analyses,+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia.">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs.">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip.">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, 1022-1029 (2016).</li><li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+spheroid+cultures+improve+the+metabolic+gene+expression+profiles+of+HepaRG+cells.">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li></ol>

AB ve EM bu el yazması yazılmıştır anda British American Tobacco çalışanları edildi. Bu yazıda anlatılan çalışma British American Tobacco tarafından finanse edildi ve bu video yazı için yayın ücreti British American Tobacco tarafından ödendi.

Şu anda, bir çok standart toksikolojik test sistemleri, normal insan metabolizmasının 1 temsilcisi değildir işlenmiş bakteri, hücre soylarını ya da embriyonik hücreleri kullanır. Bu kimyasal veya tıp potansiyel toksik aktivitesinin yanlış tahminler yol açabilir. Bu tür bir çip üzerinde 3D hücre kültürleri ve organ olarak vitro modellerde, yenilikçi, daha insan dokuları 21, 22, 23, normal morfoloji ve metabolik aktivite çoğaltmak için bir girişimde geliştirilmektedir. Metabolik yetkinlik modelleri iyi toksikolojik değerlendirme ve ilaç biyolojik dönüşüm çalışmaları için uygun olan deşifre kullanılabilen bir kriterdir. Bu yazıda ana hatlarıyla protokol canlı hücreler kullanılarak CYP enzimlerinin aktivitesini ölçmek için tasarlanmıştır. Esnek ve 2D veya 3D KÜLTÜR farklı hücre sistemleri için kullanılabilires ve lüminojenik Probe veya kütle spektrometresi tabanlı yaklaşım kullanma seçeneğiniz mevcuttur. Her iki yöntem de malzeme nanogram miktarlarda algılar ve sadece çok oyuklu formatta yetiştirilen hücreler az sayıda gerektirecek kadar hassastır. Ayrıca küresel, uygulanabilir veya hücreler karmaşık matrisler içinde büyütülmüştür. prob substratın seçimi tabii ki protokol önemli bir unsurudur. Analizin özgüllüğü seçici CYP inhibitörü kullanılması ile elde edilebilir CYP enzim ve güvence başka bir katman seçici olan prob dayanır. alt-tabakalar ve bu yazıda belirtilen inhibitörleri sadece birkaç örnektir, fakat diğerleri literatürde bulunabilir. Enzim, düşük bir seviyede ifade edilen bağlı olabilir negatif CYP aktivitesi sonucunda yeni bir hücre tipi ile çalışan birden çok uzun kuluçka süresi dikkate alınması önemlidir. Bir pozitif kontrol olarak kullanılan bir hücre tipinin eklenmesi, söz konusu a sağlamak için tavsiye edilirNegatif sonuç teknik bir sorun ve herhangi sorun gidermeye yardımcı ile bağlantılı değildir. Primer hepatik hücreler metabolik olarak yeterlidir ve süspansiyon içinde örneğin birincil hepatositler için, kontrol olarak kullanılabilir kullanımı çok kolay olan fakat bunların canlılığı zaman içinde sınırlıdır. Karaciğer hücre çizgileri bu protokolde tarif edildiği gibi kullanımı nispeten kolaydır olası alternatifleri vardır, ama bazı metabolik aktivite 6, 21 açısından, diğerlerinden daha iyi olduğu. Deney toplam protein miktarı olmadıkça, yıkıcı olmayan, olduğu için, uzunlamasına çalışmalarda 20, zaman içinde CYP aktivitesi takip etmek mümkündür. Bazı hücreler kültürde zamanla değişken CYP aktivitesini olacak, çünkü bu önemli bir noktadır. Negatif bir sonuç, in vitro olarak farklılaşma ya da farklılaşmanın giderilmesi ile birleşmeye eksikliği, ilerleme ile ilişkili olabilir. Bu durumda, bu yaklaşım, yarı kantitatif bir olduğuVeriler, her hücre kültürü içinde protein toplam miktarına göre normalize değildir çünkü ettik. TCDD için olduğu gibi doku üzerinde toksik bir etkiye sahip olabilir probları, inhibitörleri, veya teşvik edicilere maruz kalma gibi CYP aktivitesinin ölçülmesi sonra doku yeniden her zaman mümkün değildir ya da önerilmez. gibi mikrozomlar gibi hücre fraksiyonları, aynı zamanda, belirli bir hücre tipinin, CYP aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılabilir. Mikrozomal preparasyonlar, bununla birlikte, hücre malzemesi, uygun eş-faktörlerin eklenmesi bir çok ihtiyaç ve enzimler aktif kalmasını sağlamak için tampon. canlı hücreleri kullanarak zor mikrozom hazırlık aşamasını ortadan kaldırır ve tamponlar ve ko-faktörler en çok hangi çalışma dışarı. Genel bir öneri olarak, ayrıca, enzimatik aktivitesini aynı olduğunu doğrulamak için, hücre kültürlerinde CYP&#39;ler ekspresyon profilini karakterize etmek için en iyi yöntemdir. doğrulama Bu ek seviye metabolik sondalar Enti olmadığını verilmiş tavsiye edilirTek bir CYP özgü bel ve ölçülen metabolik aktivitesi, ilgili enzim ekspresyonu ile eşleştirilir artan bir güven vermektedir. CYP zar proteinlerini olduğu bu nedenle nicel RT-PCR, bu enzimleri 20 profil tercih edilen bir yaklaşım olmuştur, Western blotlar için hazırlamak için nispeten zordur. Protokol, tek önemli bir şekilde de olsa, metabolik enzimlerin bir ailesini temsil eder deney CYP enzim aktivitesi için bir yöntem açıklanır dikkat etmek önemlidir. Bir kütle spektrometresi yaklaşımın esnekliği prob substratlar diğer metabolik dönüşümler için satın alma yöntemlerinin geliştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu bir anda geliştirilecek ve şu anda bilinen daha az spesifik problar ve diğer metabolik enzim ailesi için seçici inhibitörler vardır. Bu boşluk, in vitro hücre sistemlerin t metabolik yeterlilik kapsamlı bir değerlendirme sağlamak için ele alınmalıdırMS.

Ksenobiyotik metabolizma vücuda yabancı kimyasal atılımını 1 kolaylaştırmak için hidrofilik grupların ve bunların konjugatları eklenmesi ile modifiye olan süreçtir. Tipik olarak ksenobiyotiklerin metabolizma bir ya da birden fazla hidroksil grubu 1, 2 ilavesi ile bir oksidasyon çoğunlukla oluşan Faz iki aşamalı bir işlemdir. Örneğin glukuronid veya bir sülfat kısmı 1, 2 gibi bir hidrofobik konjugat için alıcılar olarak Faz II, hidroksil grupları kullanılır. bir alıcı grup zaten molekül üzerinde mevcut ise, konjugasyon adım, bağımsız Faz I metabolizma olabilir. Her bir reaksiyon kimyasal alt tabakalar 3 belirli bir enzimin grubu, örneğin, hidroksilasyon katalize CYP (sitokrom P450), (Şekil 1) ve dealkilasyon ile gerçekleştirilir. ConjugatioN sulfotransferazlar ile katalize edilir, UDP-Glukuronosiltransferazı (Şekil 1), glutation-S-transferaz ve N-asetiltransferaz 4. Her bir doku ve organ bu proteinlerin en ifade karaciğer ile, belirli bir metabolik enzim sentezleme profiline sahip olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Şekil 1: Faz I ve kumarin için Faz II Metabolizmasının örneği. CYP2A6 / kumarin 7-hidroksilasyonu katalize CYP2A13. 7-hidroksikumarin UGT1A6 ve UGT1A9 yüksek etkinlik gösteren, faz II enzimleri UGTs bir glukuronid parçasına konjuge olur. ksenobiotiklerin metabolizmasını anlamak iki nedenden dolayı ilaç güvenliğinin değerlendirilmesinde ve kimyasal risk değerlendirmesi için önemlidir: reaksiyon kinetiği bir uyuşturucu veya kimyasal aktif veya inaktif formu b vücutta ne kadar süre yeni belirleyecekefore boşaltım; ve ana bileşiğin metabolik enzimler tarafından daha reaktif olmayan ve toksik türler için değiştirilebilir. Aynı zamanda &quot;biyoaktivasyon&quot; olarak bilinen bu tür reaksiyonlar çoğunlukla, aynı zamanda, faz II konjugasyon 5 ile nadir durumlarda enzimler CYP faz ile tahrik edilmektedir. Buna göre, doğru bir ilaç ya da bir kimyasal ile bağlantılı risk tahmin etmek için bir in vitro modelinin özelliği, hücre sistemine bağlı oksijen yetkinlik oldukça bağımlıdır. Hastalıklı dokulardan ya da normal hücrelerin transformasyonu türetilmiş hücre çizgileri genelde bir parçası değilse kökenli 6 bunların dokunun metabolik enzim profili temsil tüm kaybeder. Normal metabolik enzim profili bakımı (en azından kısa süreli kültürlerde), birincil hücre kültürleri daha iyi görünür ve doku onun 3 boyutlu yapısını 1 muhafaza sağlayan bir matris içinde kültürlenir ise daha artırıldı. Bu nedenle, Charbir in vitro hücre sistemine bağlı oksijen yeterliliğin acterization hücre modeli kimyasal güvenlik değerlendirme yapmak için uygun olan ilgili bir karar kılavuz önemli bir ön adımdır. Bu yazıda bir karaciğer hücre çizgisi 7 ve 3D primer akciğer hücre kültürleri 8 ile uygulama örnekleri ile in vitro aktivite ve Faz I CYP enzimlerinin ekspresyonunu profil bir protokol mevcut. CYP özel alt-tabakalar, bunların metabolik ürünleri ve önleyici kontrol kütle spectrometry- ve lüminojenik tabanlı miktar yöntemler ile birlikte tarif edilmiştir. Bazı CYP uyarılabilir ve diğerleri kurucu olduğu için, örnek aynı zamanda bu iki senaryo için verilecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="697">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Reagent &#38; Cells</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 &#956;m syringe filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>UN203NPEORG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-phenyl pentyne</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CD5001437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxybupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-hydroxychlorzoxazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>UC148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-ethoxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>195642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-hydroxycoumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H24003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8-methoxypsoralen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A/0626/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-naphthoflavone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N5757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BCA kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-glucuronidase/arylsulfatase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bupropion</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carbamazepine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chlorzoxasone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">collagen</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coumarin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disulfiram</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>86720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluvoxamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax (Glutamine supplement)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG metabolism supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMAD621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG thaw media supplement</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMADD671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HepaRG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MMHPR116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luciferin-CEE</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MucilAir airway cells</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">MucilAir airway cells maintenance media</td>
			<td>Epithelix</td>
			<td>EP04MM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phenomenex Kinetex 2.6&#956;m, PFP 100A</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00B-4477-AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TCDD</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>48599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">thioTEPA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:276px;">Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8&#181;m 2.1 x 50mm</td>
			<td>Waters</td>
			<td>86003538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217; E media</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17704-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td>Acquity</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>ABI Sciex 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QTRAP MS software</td>
			<td>Sciex&#160;</td>
			<td>Analyst 1.4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luminometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax M3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cell counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Vi-Cell XR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotary evaporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry and luminogenic-based approaches to characterize phase i metabolic competency of in vitro cell cultures

Ksenobiyotik metabolize eden enzimlerin çözünürlüğü arttırmak ve salgılanmasını kolaylaştırmak fonksiyonel gruplar ilave etmek suretiyle ilaç ve toksik biyotransformasyonu önemli bir işlev görür. Bazı durumlarda, bu yapısal değişiklikler yeni toksik ürünlerin oluşumuna yol açar. hayvanlar üzerinde test azaltmak amacıyla, kimyasal risk metabolik olarak yetkin hücreleri kullanılarak değerlendirilebilir. Metabolik enzimlerin ifadesi, buna rağmen, nitro, birincil kültür sistemlerinde bir çok zaman içinde kararlı değildir ve çoğu zaman hücre çizgilerinde kısmi veya mevcut değildir. Bu nedenle, in vitro ilaç, katkı maddeleri, ve çevre kirliliği yaratanlar metabolizma çalışma ideal metabolik aktivite ile karakterize edilmiştir hücre sistemlerinde yürütülmelidir. Biz UPLC kütle spektrometresi ile ölçülebilir kimyasal probları ve metabolik ürünlerini kullanarak 2B hücre hatları ve primer 3D kültürlerinde metabolik enzimler sınıfının aktivitesini (insan Faz I) ölçmek için, bir yaklaşım açıklar veluminometri. yöntem hücre kuşakları ve çeşitli dokulardan elde edilen birincil hücreler metabolik aktiviteyi test etmek için uygulanabilir.

Üç farklı vericiden (hava yolu M360, M370, M417) ve karaciğer hücre çizgisi (Hep hattı) &#39;, hava yolu hücre kültürlerinde iki CYP&#39;ler çiftleri (CYP1A1 / 1B1 ve CYP2A6 / 2A13) için ölçülen metabolik aktivite örnekleri Şekil 6&#39;da gösterilmiştir 20. CYP aktivitesi luminometri ile ölçüldüğü Şekil 6A, hava yolu hücreleri Luc-CEE (luciferase 6&#39;-kloroetil eter) (3 donör) ile TCDD uyandırılmadan karaciğer hücrelerinin CYP1A1 / 1B1 O-dealkilasyon aktivitesi ile üretilen göreli lüminesans gösterir. CYP1A1 / 1B1 yüksek oranda indüklenebilen enzimlerdir ve tipik olarak çoğu dokuda bir kurucu seviyede ifade edilmez. Hücreler uyarılmış zamanlarda Şekil 6A&#39;da görüldüğü gibi, herhangi bir lüminojenik sinyali tespit edilmiştir. Her iki hücre tipi TCDD, güçlü bir CYP1A1 / 1B1 indükleyici, bir işareti ile önceden inkübe edildiğindeed lüminojenik sinyal kontrol (Şekil 6A) kıyasla tespit edilir. Bu Luc-CEE prob sonra ölçülür lusiferin parçasının serbest bırakılması için lider metabolize olduğunu gösterir. Genel TCDD tedavi karaciğer hücre çizgisinden aktivitesi daha toplam protein normale döndükten sonra, hava yolu hücreleri için daha düşüktür. hücre hatları birincil hücreler daha az metabolik olarak aktif olma eğilimi beri bu olağandışı değil. α-naphthoflavone eklenmesi daha Luc-CEE metabolizmasının CYP bağımlılık teyit tüm hücre tiplerinde CYP1A1 / 1B1 aktivitesi üzerinde açık inhibitör etkisi vardır. UPLC-MS kullanılarak CYP450 Metabolitlerin miktarlarının hesaplanması Şekil 6B inhi mevcudiyetinde kumarin ve yokluğu ile inkübe edildikten sonra 3 vericiden (Hava M343, M345, M347) ve hepatik hücreleri (Hep hattı) alınan hava yolu hücrelerinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesinin ölçümü göstermektedirbitor 8-metoksipsoralenden. Veri Toplam protein için normalleştirilir. 0 dak kumarin inkübasyon kontrolünde, bir 7-hidroksikumarin (Şekil 6B) tespit edilir. CYP2A6 / 2A13 bazı dokularda temel olarak ifade edilir ve 7-hidroksikumarin bir kumarin oluşumu ile, bu nedenle daha sonra 16 saat kuluçka da indüksiyonu olmadan, test edilen farklı hücre tiplerinde tespit edilir. 8-metoksipsoralenden zaman, CYP2A inhibitörü (Şekil 6B), 7-hidroksikumarin oluşumu önemli ölçüde azalır ilave edilir. Inhibisyon nadiren tamamlanır tamamlanmaz ve diğer CYP da substratı tanıması ama çok daha az verimli bir şekilde işlemek mümkün olabilir çünkü CYP inhibitörü varlığında, hala bazı kalıntı aktivite tespit etmek normal olduğunu belirtmek gerekir. Aynı zamanda, hava yolu hücrelerinde CYP2A6 için görülebildiği gibi, birincil hücreleri kullanıldığında kaydedilen metabolik aktivite, donörler arasında farklı olabilir gözlemlenebilir(Şekil 6B). Bu CYP aktivitesi her donör genotipi ve polimorfizmleri yükümlü olduğu tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Şekil 6: Aktivite Deneyi CYP1A1 için sonuç / 1B1 aktivite (A) ve hepatik Hücre Hattı ve üç Havayolu hücre vericileri (M360, M370, M417) içerisinde CYP2A6 / 2A13 aktivitesi (B). (A) Luc-CEE dealkilasyon aktivitesi ile TCDD CYP1A1 / 1B1 indüksiyonu olmadan gösterilmiştir. α-naphthoflavone CYP1A1 / 1B1 inhibitörü olarak kullanılmıştır. Etkinlik dakika (dak) inkübasyon süresi ile normalize, göreli ışık birimi (RLU), ve toplam protein (mg) olarak ifade edilir. Bunlar temel olarak ifade edilmiştir (B) olarak CYP2A6 / 2A13 indüksiyon gerektirmez. pmol / dak / mg protein olarak Kumarin 7-hidroksilasyon aktivitesi ile ve inhibitör 8-methoxypsor olmadan farklı zaman noktalarında gösteriliralen. Tüm sonuçlar ortalamanın standart sapma ile üç bağımsız ölçümün ortalama değeri olarak sunulmuştur. Bu şekil, Baxter 20 modifiye edilmiştir. Ek Tablo 1: UPLC ve Kütle Spektrometre Ayarları. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures at JoVE.com

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

In vitro sistemlerin Metabolik yetkinlik ilaç ve toksik maddelerin biyotransformasyonu ve dışa atılması için önemli bir gereksinimdir. Bu protokol, biz Hücre kültürlerinde metabolizma faz değerlendirmek için referans metabolik sondaları uygulanmasını açıklar.

Kütle Spektrometre ve lüminojenik tabanlı Yaklaşımlar Faz I Metabolik Yetkinlik ait Characterize<em&gt; İn Vitro</em&gt; Hücre Kültürleri

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...