Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifuldt arbejde og diskussioner, og Dionne Ware til administrativ bistand. Disse undersøgelser blev støttet af National Institutes of Health Grant R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til MHC

1. Kinase Oprensningsressourcer og Generel Immun Udfældning Pipeline BEMÆRK: Kinaser til anvendelse med dette assay kan hidrøre fra immunpræcipitater af dyrkede celler eller ved rekombinante midler, såsom affinitetsmærket rensning 6 . Nedenfor er en generel protokol for flag-mærket immunpræcipitation, som muligvis skal modificeres afhængigt af kinasen af ​​interesse. Alt skal holdes på is når det er muligt. <ol><li> Tilsæt 2 μl 1 mg / ml antistof ti...

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Kinaser er en forskelligartet familie af proteiner, der har udviklet stor funktionalitet i mange sammenhænge, ​​og kinaseanalyser har været utroligt nyttige til at studere flere signalproteiner og har i høj grad bidraget til vores nuværende forståelse af cellulær kommunikation. Navnlig blev det samme basiske assay anvendt til karakterisering af to forskellige kinaser på trods af store forskelle i struktur og aktivitet. WNK1 kinase indeholder en atypisk katalytisk lomme, hvor den kritiske lysin har skiftet til...

Proteinkinaser er sofistikerede enzymer kritiske for transmissionen af ​​cellulære signaler i passende svar 1 . I betragtning af deres roller i at opretholde homeostase og forebyggelse eller fremme af sygdomstilstande 2 , er biokemiske metoder til vurdering af kinaseaktivitet fortsat effektive værktøjer til at afgrænse oplysningerne om eukaryotisk signalering 3 . Selvom strategier, der benytter phosphospecifikke antistoffer, har været meget informative med hensyn til måling af virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser på celle signaleringsstatus 4 , tillader et kinaseassay at måle virkningerne af forskellige behandlingsbetingelser direkte i form af enzymatisk aktivitet af en kinase af interesse. Mens der er flere muligheder for lignende analyser, der ikke bruger radioaktive materialer 5 , fortsætter vi med at anvende denne metode til robust kvantificering af resultater. derEr to typiske anvendelser af dette assay, begge værdifulde af forskellige årsager: det immunpræcipiterede (IP) kinaseassay ( Figur 1 ) og det rekombinante proteinkinase assay ( Figur 2 ). IP-kinaseassayet er yderst nyttigt til at identificere faktorer, der er i stand til at aktivere specifikke proteinkinaser såvel som måling af inhiberende behandlingsbetingelser. I korte træk transfekteres en epitop-mærket kinase af interesse i dyrkede eukaryote celler, udsættes for en række behandlinger, immunpræcipiteres og analyseres for evnen til at inkorporere radioaktivt mærket phosphat i et modelsubstrat ( fx myelinbasisk protein (MBP)). IP-kinaseassay kan også udføres uden at ty til overekspression, enten ved immunpræcipitation af endogent protein eller et hvilket som helst antal genom-redigeringsteknikker. Fordi behandlingerne administreres i kultur, kan denne metode detektere stimuleringer transmitteret gennem flere opstrømsfaktorerEller parallelle veje ved in vitro- aflæsning. En stor fordel ved denne metode er, at den ikke kræver forudgående kendskab til direkte opstrøms eller nedstrøms faktorer eller phosphoryleringssteder deri. Når specifikke substrater for en interessekinase er blevet identificeret, kan specifikke kinasassayprotokoller anvendes med rekombinante komponenter til måling af specifik aktivitet over for naturlige substrater og identifikation af specifikke phosphoryleringssteder, når de kombineres med massespektrometrianalyse. Sites identificeret på denne måde kan valideres yderligere med kinaseanalyser under anvendelse af substratmutanter. Endelig kan denne metode også bruges til at detektere og måle autophosphorylering. Den heri tilvejebragte protokol antager enten et optimeret proteinrensningsskema eller transfektionsmetode til ekspression af en affinitetsmærket kinase af interesse i dyrkede celler. Til mere detaljerede udstillinger af transfektion, lysis, immunpræcipitation og proteinrensning protOcols, foreslår vi at henvise til Cold Spring Harbor Protocols 6 . For yderligere information om analyseudvikling og modifikation henvises til Proteinphosphorylation: Selected Methods in Enzymology 7 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Proteinkinaser er i stand til at styre storskala cellulære forandringer som reaktion på komplekse arrays af stimuli, og en stor indsats har været rettet mod at afdække allosteriske detaljer i deres regulering. Kinaser omfatter signaleringsnetværk, hvis defekter ofte er karakteristika for flere former for cancer og beslægtede sygdomme, hvilket gør en analyseplan til rådighed til manipulation af opstrøms regulatoriske faktorer og validering af reaktionskrav, der er kritiske i søgen efter forbedrede terapeutiske midler. Her beskriver vi et grundlæggende kinase-assay, der let kan tilpasses til specifikke eksperimentelle spørgsmål, herunder men ikke begrænset til testning af virkningerne af biokemiske og farmakologiske midler, genetiske manipulationer såsom mutation og deletion såvel som cellekulturbetingelser og behandlinger til sonde Celle signaleringsmekanismer. Dette assay udnytter radiomærkede [y-32P] ATP, som muliggør kvantitative sammenligninger og klar visualisering af resultater og kan modIfied til brug med immunopræcipiterede eller rekombinante kinaser, specifikke eller typiske substrater, over en lang række reaktionsbetingelser.

WNK1 IP kinase assays Myc-mærket WNK1 blev transficeret i HEK293-celler og immunpræcipiteret med et anti-Myc-antistof 11 . Immunpræcipitatet viste kinaseaktivitet over for modellsubstratet MBP såvel som mod sig selv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter blev derefter testet for kinaseaktivitet mod MBP ved samme metode, denne gang ved anvendelse af GST-mærket konstruktioner ( figur 1B</s...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Proteinkinaser er højt udviklede signalerende enzymer og stilladser, der er kritiske for inter- og intracellulær signaltransduktion. Vi præsenterer en protokol til måling af kinaseaktivitet ved brug af radioaktivt mærket adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en pålidelig metode til at hjælpe med at tydeliggøre cellesignalregulering.

Analyse af proteinkinaseaktivitet med radiomærket ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersøgelse Proteinsekvens-struktur-dynamik Forhold med Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikation af Cyclin-afhængig Kinase 1 specifikke fosforylering websteder ved en In Vitro -Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifikation af roman CK2 Kinase substrater ved hjælp af en alsidig biokemiske tilgang

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Forbedring af engraftment af humane inducerede pluripotente stamcelle afledte Kardiomyocytter via en forbigående hæmning af Rho Kinaseaktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...