Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00
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Os autores agradecem a todos os atuais e antigos membros do laboratório Cobb pelo valioso trabalho e discussões, e Dionne Ware pela assistência administrativa. Estes estudos foram apoiados pelo National Institutes of Health Grant R37 DK34128 e Welch Foundation Grant I1243 para MHC

1. Kinase Recursos de Purificação e General Immunoprecipitation Pipeline NOTA: As quinases para utilização com este ensaio podem ser obtidas a partir de imunoprecipitados de células cultivadas ou por meios recombinantes tais como a purificação marcada por afinidade 6 . Abaixo está um protocolo geral para a imunoprecipitação marcada por sinalização que pode ter de ser modificada dependendo da quinase de interesse. Tudo deve ser mantido em gelo quando possíve...

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	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

As quinases são uma família diversificada de proteínas que desenvolveram extensa funcionalidade em numerosos contextos e os ensaios de quinase têm sido extremamente úteis no estudo de várias proteínas de sinalização e têm contribuído muito para a nossa compreensão atual da comunicação celular. Notavelmente, o mesmo ensaio básico foi utilizado na caracterização de duas cinases diferentes, apesar das grandes diferenças de estrutura e actividade. A quinase WNK1 contém uma bolsa catalítica atípica em qu...

As cinases de proteínas são sofisticadas enzimas críticas para a transmissão de sinais celulares em respostas apropriadas 1 . Dado o seu papel na manutenção da homeostase e na prevenção ou promoção de estados de doença 2 , os métodos bioquímicos para avaliar a actividade de quinase continuam a ser ferramentas poderosas para delinear as particularidades da sinalização eucariótica 3 . Embora as estratégias que utilizam anticorpos fosfo específicos tenham sido altamente informativas em termos de medição dos efeitos de diferentes condições de tratamento no estado de sinalização celular 4 , um ensaio de cinase permite medir os efeitos de diferentes condições de tratamento directamente em termos da actividade enzimática de uma cinase de interesse. Embora existam várias opções para ensaios semelhantes que não utilizam materiais radioactivos 5 , continuamos a depender deste método para uma quantificação robusta dos resultados. LáSão duas aplicações típicas deste ensaio, ambas valiosas por razões diferentes: o ensaio de quinase imunoprecipitado (IP) ( Figura 1 ) e o ensaio de proteína quinase recombinante ( Figura 2 ). O ensaio de quinase de IP é tremendamente útil para identificar factores capazes de activar cinases de proteína específicas, bem como avaliar as condições de tratamento inibitório. Resumidamente, uma quinase marcada com epítopo de interesse é transfectada em células eucarióticas cultivadas, submetida a uma variedade de tratamentos, imunoprecipitada e ensaiada quanto à capacidade de incorporar fosfato radiomarcado num substrato modelo ( por exemplo, proteína básica de mielina (MBP)). O ensaio de quinase de IP pode também ser realizado sem recorrer à sobre-expressão, quer por imunoprecipitação de proteína endógena ou qualquer número de técnicas de edição genómica. Uma vez que os tratamentos são administrados em cultura, este método pode detectar estimulações transmitidas através de múltiplos factores a montanteOu paralelas por leitura in vitro . Uma grande vantagem deste método é que não requer conhecimento prévio de factores directos a montante ou a jusante ou sítios de fosforilação. Além disso, uma vez identificados substratos específicos para uma quinase de interesse, o mesmo protocolo de ensaio de cinase pode ser utilizado com componentes recombinantes para medir actividade específica em relação a substratos naturais e identificar locais de fosforilação específicos quando combinados com análise de espectrometria de massa. Os locais identificados desta maneira podem ser ainda validados com ensaios de quinase utilizando mutantes de substrato. Por último, este método também pode ser utilizado para detectar e medir a autofosforilação. O protocolo proporcionado aqui pressupõe um esquema de purificação de proteínas optimizado ou método de transfecção para expressar uma cinase marcada por afinidade de interesse em células cultivadas. Para exposições mais detalhadas de transfecção, lise, imunoprecipitação e protOcols, sugerimos referir-se a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obter mais informações sobre o desenvolvimento e modificação do ensaio, consulte a Fosforilação de Proteínas: Métodos Selecionados na Enzimologia 7 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

As cinases proteicas são capazes de governar mudanças celulares em grande escala em resposta a complexas matrizes de estímulos, e muito esforço tem sido direcionado para descobrir detalhes alostéricos de sua regulação. As quinases compreendem redes de sinalização cujos defeitos são frequentemente marcas de múltiplas formas de cancro e doenças relacionadas, tornando uma plataforma de análise passível de manipulação de factores reguladores a montante e validação de requisitos de reacção críticos na procura de terapêuticas melhoradas. Aqui, descrevemos um ensaio de quinase básico que pode ser facilmente adaptado para se adequar a questões experimentais específicas incluindo, mas não se limitando a, testar os efeitos de agentes bioquímicos e farmacológicos, manipulações genéticas tais como mutação e deleção, bem como condições de cultura de células e tratamentos para sondar Mecanismos de sinalização celular. Este ensaio utiliza [γ- 32 P] ATP radiomarcado, que permite comparações quantitativas e uma visualização clara dos resultados, e pode ser modSe para utilização com quinase imunoprecipitada ou recombinante, substratos específicos ou tipificados, numa vasta gama de condições de reacção.

Ensaios de quinase WNK1 IP O WNK1 marcado com Myc foi transfectado em células HEK293 e imunoprecipitado com um anticorpo anti-Myc 11 . O imunoprecipitado exibiu actividade quinase em direcção ao substrato modelo MBP assim como para si próprio ( Figura 1A ). Os mutantes WNK1 foram então testados quanto à actividade de quinase em relação a MBP pelo mesmo método, desta vez empregando...

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

As cinases de proteínas são altamente evoluídas sinalizando enzimas e andaimes que são críticos para a transdução de sinal inter e intracelular. Nós apresentamos um protocolo para medir a atividade de quinase através do uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), um método confiável para auxiliar na elucidação da regulação da sinalização celular.

Ensaio de Atividade da Proteína Quinase com ATP Radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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Bioquímica

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