Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Авторы выражают благодарность всем нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Кобба за ценную работу и обсуждения, а Дион Уэр - за административную помощь. Эти исследования были поддержаны Национальным институтом здравоохранения Грант R37 DK34128 и грантом Фонда Уэлч I1243 для MHC

1. Ресурсы для очистки киназы и общий контур иммунопреципитации ПРИМЕЧАНИЕ. Киназы, используемые для этого анализа, могут быть получены из иммунопреципитатов культивируемых клеток или с помощью рекомбинантных средств, таких как очистка с аффинной меткой 6 . ?...

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Киназы представляют собой разнообразное семейство белков, которые развили обширную функциональность в многочисленных контекстах, и киназные анализы были невероятно полезны при изучении нескольких сигнальных белков и в значительной степени способствовали нашему текущему пониманию...

Протеинкиназы являются сложными ферментами, критичными для передачи клеточных сигналов в соответствующие реакции 1 . Учитывая их роль в поддержании гомеостаза и предупреждении или развитии болезненных состояний 2 , биохимические методы оценки активности киназы продолжают оставаться мощным инструментом для определения особенностей передачи сигналов эукариот 3 . Хотя стратегии, использующие фосфоспецифические антитела, были в высшей степени информативными с точки зрения измерения влияния различных условий лечения на статус 4 передачи сигнала в клетке, анализ киназы позволяет измерять эффекты различных условий лечения непосредственно в терминах ферментативной активности киназы интерес. Хотя существует несколько вариантов аналогичных анализов, которые не используют радиоактивные материалы 5 , мы по-прежнему полагаемся на этот метод для надежного количественного определения результатов. ТамЯвляются двумя типичными применениями этого анализа, которые являются ценными по различным причинам: анализ иммунопреципитата (IP) киназы ( рисунок 1 ) и анализ рекомбинантной протеинкиназы ( рисунок 2 ). Анализ киназы IP чрезвычайно полезен для идентификации факторов, способных активировать специфические протеинкиназы, а также для оценки условий ингибирующего лечения. Вкратце, интересующую киназу эпитопа, представляющую интерес, трансфицируют в культивируемые эукариотические клетки, подвергают множеству обработок, иммунопреципитируют и анализируют на способность включать радиоактивно меченный фосфат в модельный субстрат ( например, основной миелиновый белок (MBP)). Анализ киназы IP также может быть выполнен без использования избыточной экспрессии либо путем иммунопреципитации эндогенного белка, либо с использованием любого количества методов редактирования генома. Поскольку лечение проводится в культуре, этот метод может обнаруживать стимуляции, передаваемые через множественные восходящие факторыИли параллельных путей путем считывания in vitro . Одним из основных преимуществ этого метода является то, что он не требует предварительного знания прямых восходящих или нисходящих факторов или сайтов фосфорилирования в нем. Более того, как только определенные субстраты для представляющей интерес киназы были идентифицированы, такой же протокол анализа киназы может быть использован с рекомбинантными компонентами для измерения удельной активности в отношении природных субстратов и идентификации специфических сайтов фосфорилирования в сочетании с масс-спектрометрическим анализом. Сайты, идентифицированные таким образом, могут быть дополнительно подтверждены киназными анализами с использованием субстратных мутантов. Наконец, этот метод можно также использовать для обнаружения и измерения аутофосфорилирования. Протокол, представленный здесь, предполагает либо оптимизированную схему очистки белка, либо способ трансфекции для экспрессии меченой сродства киназы, представляющей интерес в культивируемых клетках. Для более подробных описаний трансфекции, лизиса, иммунопреципитации и протеиновой очисткиОколей, мы предлагаем сослаться на протоколы Cold Spring Harbor 6 . Для получения дополнительной информации относительно разработки и модификации анализов, пожалуйста, обратитесь к Фосфорилированию белков: Избранные методы в энзимологии 7 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Протеинкиназы способны регулировать крупномасштабные клеточные изменения в ответ на сложные массивы раздражителей, и много усилий было направлено на выявление аллостерических деталей их регуляции. Киназы содержат сигнальные сети, дефекты которых часто являются признаками множественных форм рака и связанных с ними заболеваний, что делает платформу для анализа подходящей для манипулирования восходящими регуляторными факторами и валидации реакционных требований, критически важных для поиска улучшенных терапевтических средств. Здесь мы опишем базовый анализ киназы, который может быть легко адаптирован для удовлетворения конкретных экспериментальных вопросов, включая, но не ограничиваясь ими, тестирование эффектов биохимических и фармакологических агентов, генетических манипуляций, таких как мутация и делеция, а также условий культивирования клеток и методов лечения для зондирования Клеточные сигнальные механизмы. В этом анализе используется радиоактивно меченный [γ-32P] АТФ, который позволяет проводить количественные сравнения и четкую визуализацию результатов, и может быть модифицированнымДля использования с иммунопреципитированной или рекомбинантной киназой, специфическими или типизированными субстратами, во всем широком диапазоне условий реакции.

Анализы киназы IP WNK1 Myc-меченный WNK1 трансфицировали в клетки HEK293 и иммунопреципитировали антителом против Myc11. Иммунопреципитат проявлял киназную активность по отношению к модельному субстрату МВР, а также к себе ( рисунок 1А ). З...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Протеинкиназы представляют собой высокоразвитые сигнальные ферменты и каркасы, которые являются критическими для меж- и внутриклеточной передачи сигнала. Мы представляем протокол для измерения активности киназы с использованием радиоактивно меченого аденозинтрифосфата ([γ- 32 P] ATP), надежного метода, помогающего выявлять регуляцию клеточной сигнализации.

Анализ активности протеинкиназы с радиоактивно меченым АТФ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Исследование последовательности протеинов-структуры-динамики Отношения с Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Идентификация Циклин зависимая киназа 1 сайты конкретных фосфорилирование киназы в Vitro пробирного

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Идентификация Роман CK2 киназы субстратов, используя универсальный подход биохимические

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Скрининг ингибиктора Киназы в самособранных микроарах человеческого белка

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Создание высокоспецифических химически индуцированных систем димеризации белка по шагу Phage Выбор комбинаторных однодоменных антител библиотеки

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...