Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Författarna tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Cobb-laboratoriet för värdefullt arbete och diskussioner, och Dionne Ware för administrativt bistånd. Dessa studier stöddes av National Institute of Health Grant R37 DK34128 och Welch Foundation Grant I1243 till MHC

1. Kinasreningsresurser och allmän immunprecipitationsledning OBS: Kinaser för användning med denna analys kan erhållas från immunoprecipitater av odlade celler eller genom rekombinanta medel, såsom affinitetsmärkta rening 6 . Nedan finns ett allmänt protokoll för flagg-märkt immunutfällning som kan behöva modifieras beroende på kinas av intresse. Allt bör hållas på is när det är möjligt. <ol><li> Tillsätt 2 μl 1 mg / ml antikropp till 200 μl c...

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Kinaser är en mångsidig familj av proteiner som har utvecklat en omfattande funktionalitet i många sammanhang och kinasanalyser har varit otroligt användbara vid studier av flera signalproteiner och har starkt bidragit till vår nuvarande förståelse av cellulär kommunikation. I synnerhet användes samma basanalys för att karakterisera två olika kinaser trots stora skillnader i struktur och aktivitet. WNK1-kinas innehåller en atypisk katalytisk ficka där den kritiska lysinen har förskjutits till en unik posit...

Proteinkinaser är sofistikerade enzymer kritiska för överföring av cellulära signaler till lämpliga svar 1 . Med tanke på deras roller för att upprätthålla homeostas och förebyggande eller främjande av sjukdomstillstånd 2 fortsätter biokemiska metoder för att bedöma kinasaktivitet att vara kraftfulla verktyg för att avgränsa uppgifterna om eukaryotisk signalering 3 . Även om strategier som utnyttjar fosforspecifika antikroppar har varit mycket informativa när det gäller mätning av effekterna av olika behandlingsbetingelser på cellsignalstatus 4 möjliggör en kinasassay att mäta effekterna av olika behandlingsbetingelser direkt i termer av enzymatisk aktivitet hos en kinas av intressera. Även om det finns flera alternativ för liknande analyser som inte använder radioaktiva material 5 , fortsätter vi att förlita oss på denna metod för robust kvantifiering av resultat. därÄr två typiska tillämpningar av denna analys, båda värdefulla av olika skäl: den immunprecipiterade (IP) -kinasanalysen ( Figur 1 ) och den rekombinanta proteinkinasanalysen ( Figur 2 ). IP-kinasassayen är oerhört användbar för att identifiera faktorer som kan aktivera specifika proteinkinaser såväl som mätningshämmande behandlingsbetingelser. I korthet transfekteras en epitopmärkt kinas av intresse i odlade eukaryota celler, utsätts för en mängd behandlingar, immunprecipiterade och analyseras för förmågan att införliva radiomärkt fosfat i ett modellsubstrat ( t.ex. myelinbaserat protein (MBP)). IP-kinasassay kan också utföras utan att tillgripa överuttryck, antingen genom immunutfällning av endogent protein eller något antal genom-redigeringstekniker. Eftersom behandlingar administreras i kultur kan denna metod detektera stimuleringar som överförs genom flera uppströmsfaktorerEller parallella vägar genom in vitro- avläsning. En stor fördel med denna metod är att den inte kräver förkunskaper om direkta uppströms eller nedströms faktorer eller fosforyleringsställen däri. Vidare, när specifika substrat för en intressant kinas av intresse har identifierats kan samma kinasassayprotokoll användas med rekombinanta komponenter för att mäta specifik aktivitet mot naturliga substrat och identifiera specifika fosforyleringsställen när de kombineras med masspektrometrianalys. Platser som identifieras på detta sätt kan valideras ytterligare med kinasassays med användning av substratmutanter. Slutligen kan denna metod också användas för att detektera och mäta autofosforylering. Protokollet som tillhandahålls här förutsätter antingen ett optimerat proteinreningsschema eller transfektionsmetod för att uttrycka en affinitetsmärkad kinas av intresse i odlade celler. För mer detaljerade exponeringar av transfektion, lysis, immunutfällning och proteinreningsprotokollOcols, föreslår vi att vi hänvisar till Cold Spring Harbor Protocols 6 . För mer information om analysutveckling och modifiering hänvisas till Proteinfosforylering: Utvalda metoder i Enzymologi 7 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Proteinkinaser kan styra storskaliga cellförändringar som svar på komplexa stimuleringsstammar, och mycket ansträngning har gjorts för att avslöja allosteriska detaljer i deras reglering. Kinaser innefattar signaleringsnät vars defekter ofta är kännetecken för flera former av cancer och besläktade sjukdomar, vilket gör en analysplattform möjlig för manipulation av uppströms reglerande faktorer och validering av reaktionskrav som är kritiska i sökandet efter förbättrade terapeutiska medel. Här beskriver vi en grundläggande kinasassay som enkelt kan anpassas för att passa specifika experimentella frågor inklusive men inte begränsat till testning av effekterna av biokemiska och farmakologiska medel, genetiska manipuleringar såsom mutation och deletion såväl som cellodlingsförhållanden och behandlingar för att sondra Cellsignaleringsmekanismer. Denna analys utnyttjar radiomärkt [y-32P] ATP, vilket möjliggör kvantitativa jämförelser och tydlig visualisering av resultat och kan vara modIfied för användning med immunprecipiterat eller rekombinant kinas, specifika eller typifierade substrat, över ett brett spektrum av reaktionsbetingelser.

WNK1 IP-kinasanalyser Myc-märkt WNK1 transfekterades in i HEK293-celler och immunopfälldes med en anti-Myc-antikropp 11 . Immunprecipitatet visade kinasaktivitet gentemot modellsubstratet MBP såväl som mot sig själv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter testades sedan för kinasaktivitet mot MBP med samma metod, denna gång med användning av GST-märkta konstruktioner ( Figur IB</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Proteinkinaser är högutvecklade signalerande enzymer och byggnadsställningar som är kritiska för inter- och intracellulär signaltransduktion. Vi presenterar ett protokoll för mätning av kinasaktivitet genom användning av radioaktivt märkt adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en tillförlitlig metod som hjälper till att belysa cellsignalreglering.

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Undersökande Proteinsekvens-struktur-dynamik Förhållanden med Bio3D-webben

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Identifiering av romanen CK2 Kinase substrat med en mångsidig biokemisk metod

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studera RNA interactmedlemmar av proteinkinas RNA-aktiverad under däggdjur cellcykeln

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Förbättra inympningen av humana inducerade pluripotenta stamcells-härledda Kardiomyocyter via en övergående hämning av Rho-Kinas aktivitet

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...