Name: assaying protein kinase activity with radiolabeled atp
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Yazarlar değerli çalışmalar ve tartışmalar için Cobb laboratuarı eski ve eski üyelerine ve idari yardım için Dionne Ware&#39;e teşekkür ederler. Bu çalışmalar Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R37 DK34128 ve MHC&#39;ye Welch Vakfı Grant I1243 tarafından desteklenmiştir

1. Kinaz Saflaştırma Kaynakları ve Genel İmmünopresipitasyon Boru Hattı NOT: Bu testle birlikte kullanılacak kinazlar, kültürlenmiş hücrelerin immüno çöktürmelerinden veya afinite etiketli saflaştırma gibi rekombinant vasıtalarla elde edilebilir 6 . Aşağıda, ilgilenilen kinaza bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilecek bayrak etiketli immüno çökeltme için genel bir protokol bulunmaktadır. Mümkün olduğunca her şey buz üzerinde tutulmalı...

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

Kinazlar sayısız bağlamda kapsamlı işlevsellik geliştirdiler proteinlerin bir ailesidir ve kinaz tahlilleri birkaç sinyal protein incelenmesi için inanılmaz faydalı olmuştur ve hücresel iletişim mevcut mevcut anlayışımıza büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Özellikle yapı ve aktivitede büyük farklılıklara rağmen iki farklı kinazın karakterizasyonunda aynı temel tahliller kullanılmıştır. WNK1 kinazı, kritik lizin eşsiz bir konuma kaymış ve hem kinaz hem de iskele işlevleri yoluyla...

Protein kinazlar, hücresel sinyallerin uygun cevaplara iletilmesi için kritik olan sofistike enzimlerdir 1 . Homeostazın korunması ve hastalık durumlarının önlenmesi veya yükseltilmesindeki rolleri göz önüne alındığında, kinaz aktivitesini değerlendirmeye yönelik biyokimyasal yöntemler, ökaryotik işaretlemenin ayrıntılarını açıklamak için güçlü araçlar olmaya devam etmektedir 3 . Fosfoya özgü antikorları kullanan stratejiler, farklı tedavi koşullarının hücre sinyal durumu 4 üzerindeki etkilerini ölçmek açısından son derece bilgilendirici olmasına rağmen, bir kinaz tahlili, farklı tedavi koşullarının doğrudan bir kinaz enzim aktivitesi açısından ölçülmesini sağlar. faiz. Benzer tahliller için radyoaktif materyal 5&#39;i kullanmayan çeşitli seçenekler olsa da, sonuçların sağlıklı bir şekilde ölçülmesi için bu metoda güveniyoruz. Orada, Bu tahlilin, farklı nedenlerle değerli olan iki tipik uygulamasıdır: immüno çökeltilmiş (IP) kinaz tahlili ( Şekil 1 ) ve rekombinant protein kinaz tahlili ( Şekil 2 ). IP kinaz tahlili, spesifik protein kinazları aktive edebilen faktörleri tanımlamak ve inhibe edici tedavi koşullarını belirlemek için çok yararlıdır. Kısaca, ilgilenilen bir epitopla etiketlenmiş kinaz kültürlenmiş ökaryotik hücrelere aktarılır, çeşitli tedavilere tabi tutulur, immüno-çökeltilir ve radyoaktif işaretlenmiş fosfatın bir model substrata ( örn., Miyelin bazik protein (MBP)) dahil edilme yeteneği açısından denenmiştir. IP kinaz tahlili, endojen proteinin immüno-çökmesi veya herhangi sayıda genom düzenleme tekniği ile aşırı ekspresyona başvurmadan da yapılabilir. Tedaviler kültüre uygulandığından, bu yöntem çok sayıda yukarı akış faktörü aracılığıyla iletilen uyarıları tespit edebilirVeya paralel yolaklarda in vitro okuma yoluyla. Bu yöntemin en önemli bir avantajı, direkt yukarı akış veya aşağı akış faktörlerine veya fosforilasyon bölgelerine ilişkin önceden bilgi gerektirmediğidir. Dahası, ilgilenilen bir kinaz için spesifik substratlar belirlendikten sonra, aynı kinaz tahlil protokolü, doğal substratlara karşı spesifik aktiviteyi ölçmek ve rekombinant bileşenlerle birlikte kütle spektrometresi analizi ile birleştirildiğinde spesifik fosforilasyon yerlerini belirlemek için kullanılabilir. Bu şekilde tanımlanan bölgeler, substrat mutantlarını kullanan kinaz tahlilleriyle daha da doğrulanabilir. Son olarak, bu yöntem otofosforilasyonu saptamak ve ölçmek için de kullanılabilir. Burada verilen protokol, kültürlenmiş hücrelerde ilgi çekici bir etiketlenmiş kinazın ekspresyonu için optimize edilmiş bir protein saflaştırma şeması veya transfeksiyon yöntemi varsayar. Transfeksiyon, lizis, immüno çökeltme ve protein saflaştırma protokolünün daha ayrıntılı sergilenmesi içinOcols, Cold Spring Harbor Protocols 6&#39;ya atfen öneriyoruz. Test geliştirme ve modifikasyonu hakkında daha fazla bilgi için, Protein Fosforilasyonu: Enzimolojide Seçilmiş Yöntemler 7&#39;ye bakın .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

Protein kinazlar, kompleks uyarı dizilerine yanıt olarak büyük ölçekli hücresel değişiklikleri yönetebilir ve düzenlemelerinin allosterik ayrıntılarını açığa çıkarmak için çok çaba harcanmıştır. Kinazlar, kusurları çoğunlukla birden fazla kanser türü ve ilgili hastalıkların özelliklerini gösteren işaret şebekelerini içerir ve bu sayede iyileştirici terapötik araştırmalarında kritik olan reaksiyon gereksinimlerinin geçerliliği için bir analiz platformu oluşturulabilir. Burada, biyokimyasal ve farmakolojik ajanlar, mutasyon ve silme gibi genetik manipülasyonların yanı sıra hücre kültürü koşulları ve problara uygulanan tedavilerin testleri de dahil ancak bunlarla sınırlı olmayan spesifik deneysel sorulara uyacak şekilde kolayca adapte edilebilen basit bir kinaz testini açıkladık Hücre sinyal mekanizmaları. Bu tahlil, niceliksel karşılaştırmalara ve sonuçların net görselleştirilmesine imkan tanıyan radyoaktif işaretlenmiş [γ- 32 P] ATP&#39;yi kullanır ve mod olabilirImmüno-çökeltilmiş veya rekombinan kinaz, spesifik veya tipik substratlar ile birlikte kullanım için geniş bir yelpazede reaksiyon koşullarına sahiptir.

WNK1 IP kinaz tahlilleri Myc etiketli WNK1, HEK293 hücrelerine transfekte edildi ve bir anti-Myc antikoru 11 ile immüno-çökeltildi. İmmünopresipitat model substrat MBP&#39;ye ve kendisine doğru kinaz aktivitesini göstermiştir ( Şekil 1A ). Daha sonra WNK1 mutantları aynı usulle MBP&#39;ye karşı kinaz aktivitesi için test edildi, bu kez GST etiketli yapılar kullanıldı ( <s...

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP at JoVE.com

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biochemistry

Unit 1

Protein Function

SCIENTISTS IN ACTION

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

Bio3D-web ile Protein Dizisi-yapı-dinamikleri İlişkilerinin İncelenmesi

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Rho kinase aktivitesinin geçici Inhibisyonu ile ınsan kaynaklı pluripotent kök hücreli türev Kardiyomiyositlerin engraftment artırılması

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...