Name: detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Wir danken Miyako Shigeta für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI (Grant Nummer 25461252) unterstützt.

Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Tierethikkomitee der Jichi Medical University genehmigt und wurden im Einklang mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Experimental Animals von der Jichi Medical University Guide für Labortiere durchgeführt. 1. Peritoneum Probensammlung <ol><li> Sammeln Sie die folgenden Gegenstände: 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Baumwolle in Isofluran, Korkplatte, Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), chirurgischer Schere und P...

<ol>
	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. 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M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

Unter Verwendung des in diesem Manuskript dargestellten Protokolls wurden miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich gereinigt und unter Verwendung von qRT-PCR nachgewiesen. Die Zuverlässigkeit der qRT-PCR-Datenanalyse hängt von der Qualität der gereinigten miRNAs ab. Daher kann die Reinheit von miRNAs vor der qRT-PCR durch das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm zu dem bei 280 nm überprüft werden, was mit einem Spektrophotometer gemessen werden kann. Wenn eine signifikante Amplifikation von miRNA nicht u...

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die post-transkriptional die messenger RNA (mRNA) Expression 1 regulieren. Veränderungen in der Expression von miRNAs regulieren die Expression vieler mRNAs, die in verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Fibrose, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , eine zentrale Rolle spielen. Daher haben miRNAs als neuartige Biomarker und therapeutische Ziele 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 Potenzial. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Ratten bestimmtOrgane und Gewebe, einschließlich Leber, Herz, Lunge und Niere 9 . Allerdings sind Standardmethoden zur Reinigung und Detektion von miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert. Das Gesamtziel dieses Protokolls besteht darin, miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich zu reinigen und zu detektieren. Zuerst wurde die Peritonealmembranprobe unter Verwendung eines Glashomogenisators homogenisiert, gefolgt von einer Exposition gegenüber einem Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule 10 . Als nächstes wurde die Gesamt-RNA, die miRNA enthielt, aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule 10 auf Siliciumdioxid-Membran-Basis gereinigt. Dann wurde cDNA aus der gereinigten Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer 11 synthetisiert. Schließlich wurde die Expression von miRNA durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs 11 bestimmt . Die Begründung dieses Protokolls ist bAuf früheren Studien, die eine signifikante Reinigung und Nachweis von miRNA in Geweben durch ein einfaches Verfahren 8 , 10 , 11 zeigten. Es wurde berichtet, dass die Verwendung eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule und einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis eine hochqualitative Gesamt-RNA aus den Geweben 10 reinigen kann. Das Verfahren zur Synthese von cDNA aus gereinigter Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer und das Verfahren zum Nachweis der miRNA-Expression durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs in diesem Protokoll wurde mit hoher Genauigkeit und einer hohen Genauigkeit beschrieben Empfindlichkeit 11 Darüber hinaus ist dies ein einfacher Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert Daher ist dieses Protokoll in Studien nützlich, die einen hochgenauen und empfindlichen Nachweis von miRNA in der Ratten-Peritonealmembran in einem breiten Bereich von pathologischen Zuständen erfordern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Messenger-RNA-Expression posttranskriptional regulieren. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Organen und Geweben bei Ratten untersucht. Allerdings sind Standardmethoden für die Reinigung von miRNAs und den Nachweis ihrer Expression in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert. Wir haben eine wirksame und zuverlässige Methode entwickelt, um miRNAs mit quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) in Ratten-Peritonealmembran zu reinigen und zu quantifizieren. Dieses Protokoll besteht aus vier Schritten: 1) Reinigung der Peritonealmembranprobe; 2) Reinigung der Gesamt-RNA einschließlich miRNA aus der Peritoneal-Membranprobe; 3) reverse Transkription von miRNA zur Erzeugung von cDNA; Und 4) qRT-PCR zur Detektion der miRNA-Expression. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich festgestellt, dass die Expression von sechs miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p) zunahmSignifikant in der Peritonealmembran eines Ratten-Peritoneal-Fibrose-Modells im Vergleich zu denen in Kontrollgruppen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Profil der miRNA-Expression in der Peritonealmembran von Ratten in vielen pathologischen Zuständen zu untersuchen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse basieren auf unserer bisher gemeldeten Studie 8 . Wir untersuchten das miRNA-Expressionsprofil in der peritonealen Fibrose. Peritoneale Fibrose ist eine große Komplikation bei der Peritonealdialyse. Es ist durch den Verlust der mesothelialen Zellmonoschicht und die überschüssige Akkumulation von extrazellulären Matrixkomponenten gekennzeichnet und ist mit dem Peritonealmembranversagen 14 , <s...

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Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Hier stellen wir ein Protokoll für den Nachweis der microRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion vor. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung des microRNA-Expressionsprofils in der Ratten-Peritonealmembran in mehreren pathologischen Zuständen.

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Nachweis von Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts bei Patienten durch Strand-spezifische RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Quantitative RT-PCR mit hohem Durchsatz in Einzel- und Bulk-C. elegans Proben mit Nanofluidic-Technologie

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...