Name: detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

ברצוננו להודות Miyako Shigeta על התמיכה הטכנית שלה מעולה. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר 25461252).

כל הפרוטוקולים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת Jichi רפואי ונערכו בהתאם לשימוש וטיפול של הנחיות לבעלי חיים ניסיוניים מן Jichi Medical University Guide עבור חיות מעבדה. 1. פריטוניום אוסף דוגמאות <ol style=";text-al...

<ol>
	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+micromarkers.">Noninvasive micromarkers.</a> Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li><li>Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+validation+of+extracellular/circulating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression.">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals.">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes.">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer.">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> J Surg Oncol. , (2015).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis.">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Transl Res. 169, 47-66 (2016).</li><li>Minami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+expression+atlas+in+male+rat.">miRNA expression atlas in male rat.</a> Sci Data. 1, 140005 (2014).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

באמצעות פרוטוקול המוצג בכתב היד הזה, miRNAs בקרום עכברוש עכברוש טוהרו בהצלחה זוהה באמצעות qRT-PCR. האמינות של ניתוח נתונים qRT-PCR תלוי באיכות של miRNAs מטוהרים. לכן, טוהר miRNAs ניתן לבדוק לפני qRT-PCR על ידי היחס של ספיגת ב 260 ננומטר לזה ב 280 ננומטר, אשר ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר....

MicroRNAs (miRNAs) הם קצרים, RNAs לא קידוד כי שלאחר transcriptionally לווסת את השליח RNA (mRNA) ביטוי 1 . שינויים בביטוי של miRNAs להסדיר את הביטוי של mRNAs רבים אשר ממלאים תפקידים מרכזיים במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, דלקות, הפרעות מטבוליות, ו פיברוזיס 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . לכן, miRNAs יש פוטנציאל כמו ביומרקרים חדשים ומטרות טיפוליות 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . פרופיל הביטוי miRNA נקבע בעכברוש שוניםאיברים ורקמות, כולל כבד, לב, ריאה וכליות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור וזיהוי של miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא בהצלחה לטהר ולזהות miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש. ראשית, מדגם הממברנה הצפק היה homogenized באמצעות homogenizer זכוכית, ואחריו חשיפה למערכת biopolymer רטוש בעמודה microcentrifuge ספין 10 . לאחר מכן, סך כולל RNA כולל miRNA היה מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית באמצעות עמודה סיליקה מבוסס קרום סיליקה 10 . לאחר מכן, cDNA היה מסונתז מן RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל 11 . לבסוף, הביטוי של מירנה נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating 11 . הרציונל של פרוטוקול זה הוא בכמו על מחקרים קודמים שהראו טיהור משמעותי וזיהוי של מירנה ברקמות על ידי תהליך פשוט 8 , 10 , 11 . זה כבר דיווח כי השימוש במערכת biopolymer-רטוש בעמודה microcentrifuge ספין סיליקה קרום מבוסס ספין טור יכול לטהר באיכות גבוהה RNA סך מ רקמות 10 . השיטה של ​​סינתזה cDNA מ RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (א), ו אוליגו dT תחל, ואת השיטה של ​​גילוי ביטוי מירנה על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating בפרוטוקול זה דווחו כדי להראות דיוק גבוהה רגישות 11 . בנוסף, זהו תהליך פשוט, אשר חוסך זמן ומונע שגיאות טכניות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי מדויק ורגיש מאוד של מירנה בממברנה פריטוניאלית עכברוש במגוון רחב של תנאים פתולוגיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs noncoding קטנים המווסת את הביטוי RNA שליח הודעה שלאחר transcriptionally. פרופיל הביטוי miRNA נחקרה באיברים ורקמות שונים בעכברוש. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור miRNAs וזיהוי הביטוי שלהם בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. פיתחנו שיטה יעילה ואמינה לטהר לכמת miRNAs באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז (qRT-PCR) בממברנה פריטוניאלית עכברוש. פרוטוקול זה מורכב של ארבעה שלבים: 1) טיהור מדגם קרום פריטוניאלי; 2) טיהור של RNA הכולל כולל מירנה מדגם הממברנה פריטוניאלית; 3) שעתוק לאחור של מירנה לייצר cDNA; ו 4) qRT-PCR כדי לגלות ביטוי מירנה. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו בהצלחה כי הביטוי של miRNAs שישה (מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p) גדלבאופן מובהק בממברנה הצפקית של מודל חולשת הצפק של העכברוש בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של חולדות בתנאים פתולוגיים רבים.

התוצאות המוצגות כאן מבוססות על המחקר הקודם שלנו 8 . חקרנו את פרופיל הביטוי מירנה ב fibrois פריטוניאלי. סיבוך פריטוניאלי הוא סיבוך גדול בדיאליזה פריטונאלית. זה מאופיין על ידי אובדן monolayer התא mesothelial ואת הצטברות עודף של מרכיבי מטריקס תאיים, והו...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות סי.

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...