Name: detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

हम अपने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए म्याको शिगेता को धन्यवाद देना चाहेंगे। यह काम आंशिक रूप से जेएसपीएस कंकनी (अनुदान संख्या 25461252) द्वारा समर्थित था।

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जेची मेडिकल यूनिवर्सिटी की पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और प्रयोगशाला पशुओं के लिए जिची मेडिकल यूनिवर्सिटी गाइड से प्रयोगात्मक पशु निर्देशों के उपयोग ?...

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	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. 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M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रयोग, चूहा पेरीटोनियल झिल्ली में miRNAs को सफलतापूर्वक शुद्ध और qRT-PCR का उपयोग करके पता लगाया गया था। QRT-PCR डेटा विश्लेषण की विश्वसनीयता शुद्ध miRNAs की गुणवत्ता पर निर्भ?...

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) कम, गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो पोस्टर ट्रांसक्रिप्शनल मैसेजर आरएनए (एमआरएनए) एक्सप्रेशन 1 को विनियमित करते हैं। MiRNA की अभिव्यक्ति में परिवर्तन कई एमआरएनए की अभिव्यक्ति को विनियमित करते हैं जो कैंसर, सूजन, चयापचय संबंधी विकार और फाइब्रोसिस 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 सहित विभिन्न रोग स्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसलिए, miRNA में उपन्यास बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 के रूप में संभावित हैं। MiRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल विभिन्न चूहे में निर्धारित किया गया हैअंगों और ऊतकों, जिसमें यकृत, हृदय, फेफड़े, और गुर्दा शामिल हैं 9 । हालांकि, चूहा परितोषीय झिल्ली में शुद्धिकरण और miRNA के पता लगाने के लिए मानक विधियां अच्छी तरह से स्थापित नहीं हुई हैं। इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य चूहा peritoneal झिल्ली में miRNAs को सफलतापूर्वक शुद्ध और पता लगाना है। सबसे पहले, पेरीटोनियल झिल्ली का नमूना एक ग्लास होमोजिनायझर का उपयोग करके होमोजीनाइज्ड किया गया था, इसके बाद माइक्रोसेंट्रिफ्यूज स्पिन कॉलम 10 में बायोपॉलिमर-कटाई प्रणाली के संपर्क में आया था। इसके बाद, एमआरएनए सहित कुल आरएनए को एक सिलिका-झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम 10 का उपयोग करके पेरीटोनियल झिल्ली नमूने से शुद्ध किया गया था। फिर, सीडीएनए को शुद्ध कुल आरएनए से रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ओलिगो-डीटी प्राइमर 11 का इस्तेमाल किया गया था । अंत में, miRNA की अभिव्यक्ति QRT-PCR द्वारा एक अंतरंग डाई 11 का उपयोग करके निर्धारित की गई थी। इस प्रोटोकॉल का तर्क बी हैपिछले अध्ययनों के अनुसार जो एक सरल प्रक्रिया 8 , 10 , 11 द्वारा महत्वपूर्ण शुद्धि और ऊतकों में miRNA का पता लगाया। यह बताया गया है कि माइक्रोसेंट्रिफ्यूज स्पिन कॉलम और सिलिका-झिल्ली-आधारित स्पिन कॉलम में बायोपॉलिमर-कटाई प्रणाली का उपयोग ऊतकों 10 से उच्च-गुणवत्ता वाले कुल आरएनए को शुद्ध कर सकता है। रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़, पॉली (ए) पोलीमरेज़ और ऑलोगो-डीटी प्राइमर का उपयोग करके शुद्ध कुल आरएनए से सीडीएनए को संश्लेषित करने की विधि, और इस प्रोटोकॉल में इंटरकेटिंग डाई का उपयोग करके आईआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने की विधि को उच्च सटीकता दिखाने के लिए सूचित किया गया है संवेदनशीलता 11 इसके अलावा, यह एक सरल प्रक्रिया है, जो समय बचाता है और तकनीकी त्रुटि को रोकता है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल उन अध्ययनों में उपयोगी है, जो रोग संबंधी स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला में चूहे पेरीटोनियल झिल्ली में miRNA की अत्यधिक सटीक और संवेदनशील पहचान की आवश्यकता होती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं जो ट्रांस्क्रिप्शन के बाद मैसेजर आरएनए एक्सप्रैक्शन को विनियमित करते हैं। चूहे में विभिन्न अंगों और ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की गई है। हालांकि, मिरिन आरएनए की शुद्धिकरण के लिए मानक विधि और चूहे पेरीटोनियल झिल्ली में उनकी अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से स्थापित नहीं किया गया है। हमने चूहा पेरीटोनियल झिल्ली में मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qRT-PCR) का उपयोग करके miRNA को शुद्ध और मापने के लिए एक प्रभावी और विश्वसनीय तरीका विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल में चार चरण होते हैं: 1) पेरिटोनियल झिल्ली नमूने की शुद्धि; 2) पेरीटोनियल झिल्ली नमूने से miRNA सहित कुल आरएनए की शुद्धि; 3) सीडीएनए उत्पादन करने के लिए miRNA का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन; और 4) qRT- पीसीआर miRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हमने सफलतापूर्वक निर्धारित किया है कि छह miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-323, और miRNA-34a-5p) की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुईनियंत्रण समूहों में उन लोगों की तुलना में चूहे पेरीटोनियल फाइब्रोसिस मॉडल की पेरीटोनियल झिल्ली में काफी महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल कई रोग स्थितियों में चूहों के पेरिटोनियल झिल्ली में miRNA अभिव्यक्ति के प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है

यहां प्रस्तुत परिणाम हमारे पहले की रिपोर्ट किए गए अध्ययन 8 पर आधारित हैं। हमने पेरिटोनियल फाइब्रोसिस में miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच की। पेरिटोनियल फाइब्रोसिस पेरिटोनियल ड...

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Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

यहाँ हम मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का उपयोग करके चूहे पेरीटोनियल झिल्ली में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह विधि कई रोग स्थितियों में चूहा पेरीटोनियल झिल्ली में माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

क्वांटिटेटिव रीयल-टाइम पीसीआर का प्रयोग करके चूहे के पेरिटोनियल झिल्ली में माइक्रोआरएनए एक्सप्रेशन का पता लगाना

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

विलय निरपेक्ष और सापेक्ष मात्रात्मक पीसीआर डेटा Stat3 ब्याह संस्करण देखिए यों

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

नकल संख्या बदलाव की जांच सिंगल सेल अनुक्रमण का उपयोग

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

रिकॉमबिनेंट Adeno-एसोसिएटेड वायरस सीरोटाइप 9 का उपयोग कर MicroRNA की प्रणालीगत डिलिवरी कुतर में Neuromuscular रोगों का इलाज

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

द्विदिश रेट्रोवायरल इंटीग्रेशन साइट पीसीआर क्रियाविधि और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

पूर्वव्यापी MicroRNA अनुक्रमण: पूरक डीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड आरएनए नमूनों

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

टिशू-विशिष्ट miRNA में अभिव्यक्ति की रूपरेखा माउस दिल वर्गों में प्रयोग सीटू संकरण

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

स्ट्रैंड-स्पेसिफिक आरटी-पीसीआर द्वारा रोगियों में मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी-1) एंटीसेंस प्रोटीन (एएसपी) आरएनए ट्रांसक्रिप्ट का पता लगाना

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

नैनोफ्लुइडिक तकनीक का उपयोग करके एकल और बल्क सी एलिगेंस नमूनों में उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक आरटी-पीसीआर

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...