Name: detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Miyako Shigeta per il suo ottimo supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione 25461252).

Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell&#39;Università di Jichi Medical e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per l&#39;uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Animals Laboratory. 1. Raccolta di campioni peritoneali <ol><li> Raccogliere i seguenti elementi: tubo centrifuga da 50 ml con cotone inzuppato in isoflurano, foglio di sughero, piatto di Petri con soluzione sal...

<ol>
	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+micromarkers.">Noninvasive micromarkers.</a> Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li><li>Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+validation+of+extracellular/circulating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression.">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals.">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes.">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer.">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> J Surg Oncol. , (2015).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis.">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Transl Res. 169, 47-66 (2016).</li><li>Minami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+expression+atlas+in+male+rat.">miRNA expression atlas in male rat.</a> Sci Data. 1, 140005 (2014).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, miRNAs nella membrana peritoneale del ratto sono state correttamente purificate e rilevate usando qRT-PCR. L&#39;affidabilità dell&#39;analisi dei dati qRT-PCR dipende dalla qualità dei miRNA purificati. Pertanto, la purezza dei miRNAs può essere controllata prima di qRT-PCR dal rapporto di assorbanza a 260 nm a quella a 280 nm, che può essere misurato usando uno spettrofotometro. Quando non si può ottenere amplificazione significativa di miRNA utilizzando...

MicroRNAs (miRNAs) sono brevi e non codificanti RNA che regolano post-trascrizionale l&#39;espressione del messaggero RNA (mRNA) 1 . I cambiamenti nell&#39;espressione dei miRNA regolano l&#39;espressione di molti mRNA che svolgono ruoli chiave in varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, l&#39;infiammazione, i disturbi metabolici e la fibrosi 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Pertanto, i miRNA hanno potenziale come nuovi biomarcatori e target terapeutici 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Il profilo di espressione miRNA è stato determinato in vari rattiOrgani e tessuti, compreso il fegato, il cuore, il polmone e il rene 9 . Tuttavia, i metodi standard per la purificazione e la rilevazione di miRNA nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e rilevare con successo miRNA nella membrana peritoneale del ratto. In primo luogo, il campione della membrana peritoneale è stato omogeneizzato utilizzando un omogeneizzatore di vetro, seguito dall&#39;esposizione a un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di spin di microcentrifuga 10 . Successivamente, il RNA totale compreso il miRNA è stato purificato dal campione della membrana peritoneale usando una colonna di spin 10 a base di silice-membrane. Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato dal RNA totale purificato utilizzando reverse transcriptase, polimerasi di poli (A) e primer oligo-dT 11 . Infine, l&#39;espressione del miRNA è stata determinata da qRT-PCR usando un colorante intercalante 11 . La logica di questo protocollo è bIn precedenti studi che hanno dimostrato una significativa purificazione e rilevazione del miRNA nei tessuti mediante un semplice processo 8 , 10 , 11 . È stato riferito che l&#39;uso di un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga e colonna di spin a base di silicio-membrana può purificare l&#39;RNA totale di alta qualità dai tessuti 10 . Il metodo di sintetizzare il cDNA da RNA totale purificato utilizzando transcriptasi inversa, polimerasi poli (A) e primer oligo-dT e il metodo di rilevamento dell&#39;espressione di miRNA mediante qRT-PCR usando il colorante intercalante in questo protocollo sono stati riportati per dimostrare un&#39;elevata precisione e Sensibilità 11 . Inoltre, questo è un processo semplice, che consente di risparmiare tempo e di evitare errori tecnici. Pertanto, questo protocollo è utile in studi che richiedono una rilevazione altamente accurata e sensibile del miRNA nella membrana peritoneale del ratto in una vasta gamma di condizioni patologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione di RNA messaggero post-trascrizionale. Il profilo di espressione miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nel ratto. Tuttavia, i metodi standard per la purificazione di miRNA e l&#39;individuazione della loro espressione nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti. Abbiamo sviluppato un metodo efficace e affidabile per purificare e quantificare i miRNA utilizzando la reazione a catena di polimerasi a reazione inversa in tempo reale (qRT-PCR) nella membrana peritoneale del ratto. Questo protocollo è costituito da quattro fasi: 1) purificazione del campione di membrana peritoneale; 2) la purificazione di RNA totale incluso miRNA dal campione di membrana peritoneale; 3) trascrizione inversa di miRNA per produrre cDNA; E 4) qRT-PCR per rilevare l&#39;espressione di miRNA. Usando questo protocollo, abbiamo determinato con successo che l&#39;espressione di sei miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p)Significativamente nella membrana peritoneale di un modello di fibrosi peritoneale del ratto rispetto a quelli nei gruppi di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo dell&#39;espressione di miRNA nella membrana peritoneale dei ratti in molte condizioni patologiche.

I risultati qui presentati sono basati sul nostro studio precedentemente riportato 8 . Abbiamo studiato il profilo di espressione miRNA nella fibrosi peritoneale. La fibrosi peritoneale è una delle principali complicanze della dialisi peritoneale. È caratterizzato dalla perdita del monostrato di cellule mesoteliali e dall&#39;accumulo in eccesso di componenti della matrice extracellulare ed è associato all&#39;insuccesso della membrana peritoneale <sup class="x...

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Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.

Rilevamento dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

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