Name: detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr
Uploaded: 2017-06-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR at JoVE.com

그녀의 우수한 기술 지원에 대해 Miyako Shigeta에게 감사드립니다. 이 연구는 JSPS 가켄 (교부 번호 25461252)에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물 실험 프로토콜은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 얻었으며 Jichi Medical University Laboratory Animals 안내서의 Experimental Animals Use and Care of Animals 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 복막 샘플 수집 <ol><li> 다음 품목을 수집하십시오 : isoflurane, 코르크 시트, 인산염 완충 식염수 (PBS), 수술 가위 및 포 셉과 페트리 접시에 흠뻑 목화와 50 ML 원심 분리기 튜브. </li><...

<ol>
	<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis,+function+and+decay.">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).</li><li>Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-coding+RNAs+in+Development+and+Disease:+Background,+Mechanisms,+and+Therapeutic+Approaches.">Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).</li><li>Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+micromarkers.">Noninvasive micromarkers.</a> Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).</li><li>Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+validation+of+extracellular/circulating+microRNAs+during+idiopathic+pulmonary+fibrosis+disease+progression.">Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression.</a> Gene. 562 (1), 138-144 (2015).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miR-126+is+a+potential+biomarker+to+predict+the+onset+of+type+2+diabetes+mellitus+in+susceptible+individuals.">Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals.</a> Biochem Biophys Res Commun. , (2015).</li><li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21+is+a+key+therapeutic+target+for+renal+injury+in+a+mouse+model+of+type+2+diabetes.">miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+urinary+cell-free+microRNA-214+as+a+diagnostic+and+prognostic+biomarker+in+bladder+cancer.">Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer.</a> J Surg Oncol. , (2015).</li><li>Morishita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+peritoneal+fibrosis.">MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis.</a> Transl Res. 169, 47-66 (2016).</li><li>Minami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+expression+atlas+in+male+rat.">miRNA expression atlas in male rat.</a> Sci Data. 1, 140005 (2014).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+peritoneal+membrane+failure.">Pathophysiology of peritoneal membrane failure.</a> Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).</li><li>Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+the+peritoneal+membrane.">The pathophysiology of the peritoneal membrane.</a> J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).</li><li>Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+induces+peritoneal+thickening+by+mesenchymal-like+mesothelial+cells+in+rats.">Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate?.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate?.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Rockett, J. C., Hellmann, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirming+microarray+data--is+it+really+necessary?.">Confirming microarray data--is it really necessary?.</a> Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).</li></ol>

이 원고에 제시된 프로토콜을 사용하여, qRT-PCR을 사용하여 쥐 복막의 miRNA를 성공적으로 정제하고 검출 하였다. qRT-PCR 데이터 분석의 신뢰성은 정제 된 miRNA의 품질에 달려 있습니다. 따라서 miRNA의 순도는 분광 광도계를 사용하여 측정 할 수있는 280 nm에서의 흡광도 대 260 nm에서의 흡광도의 비율로 qRT-PCR 전에 확인할 수 있습니다. qRT-PCR을 사용하여 miRNA가 현저히 증폭되지 않으면 주형 cDNA의 농도가...

MicroRNAs (miRNAs)는 전 사적으로 mRNA (messenger RNA) 발현을 조절하는 짧은 비 암호화 RNA입니다. miRNA의 발현 변화는 암, 염증, 대사 장애 및 섬유증 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8을 비롯한 다양한 병리학 적 조건에서 중추적 인 역할을하는 많은 mRNA의 발현을 조절합니다. 따라서 miRNA는 새로운 바이오 마커 및 치료 표적 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 잠재력이 있습니다. miRNA 발현 프로파일은 다양한 래트에서 결정되었다간, 심장, 폐 및 신장을 포함한 장기 및 조직 9 . 그러나, 랫 복막에서 miRNA의 정제 및 검출에 대한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 이 프로토콜의 전체 목표는 성공적으로 쥐의 복막에 miRNAs을 정화하고 감지하는 것입니다. 먼저, 유리 호 모지 나이저를 사용하여 복막 막 샘플을 균질화시킨 다음, 미세 원심 분리기 스핀 컬럼 10 에서 생체 고분자 파쇄 시스템에 노출시켰다. 다음으로, 실리카 막 기반 스핀 컬럼 10을 이용하여 복막 샘플로부터 miRNA를 포함한 total RNA를 정제 하였다. 이어서 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머 11을 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 하였다. 마지막으로, 삽입 염료 11을 사용하여 qRT-PCR에 의해 miRNA의 발현을 측정 하였다. 이 프로토콜의 이론적 근거는 b이전 연구에서 단순한 과정으로 조직에서 miRNA의 유의 한 정화 및 검출을 보여주었습니다 8 , 10 , 11 . 미세 원심 분리기 스핀 컬럼과 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 생체 고분자 파쇄 시스템을 사용하면 조직에서 고품질의 총 RNA를 정제 할 수 있다고보고되었습니다. 역전사 효소, 폴리 (A) 중합 효소 및 oligo-dT 프라이머를 사용하여 정제 된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하는 방법 및이 프로토콜에서 인터 칼 레이팅 염료를 사용하는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현을 검출하는 방법이 높은 정확성을 보인 것으로보고되었다. 감도 11 . 또한이 작업은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스입니다. 따라서이 프로토콜은 광범위한 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 miRNA의 매우 정확하고 민감한 검출을 필요로하는 연구에 유용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>silica-membrane based spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>includes 10&#215; Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer&#160;&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>not disclosed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-142-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00031451</td>
			<td>5&#39;-UGUAGUGUUUCC 
			UACUUUAUGGA-3&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-21-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>5&#39;-UAGCUUAUCAG 
			ACUGAUGUUGA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-221-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003857</td>
			<td>5&#39;-AGCUACAUUGU 
			CUGCUGGGUUUC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033320</td>
			<td>5&#39;-UGUCAGUUUG 
			UCAAAUACCCC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-34a-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003318</td>
			<td>5&#39;-UGGCAGUGUCU 
			UAGCUGGUUGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-327 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00000805</td>
			<td>5&#39;-CCUUGAGGGG 
			CAUGAGGGU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylglyoxal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midperic</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td>peritoneal dialysis fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague&#8211;Dawley rats</td>
			<td>SLC</td>
			<td>not assign&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in peritoneal membrane of rats using quantitative real-time pcr

MicroRNAs (miRNAs)는 전사 후 사슬 RNA 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA입니다. miRNA 발현 프로파일은 쥐의 다양한 기관과 조직에서 조사되었습니다. 그러나, miRNA의 정제 및 쥐 복막에서의 발현 검출을위한 표준 방법은 잘 확립되어 있지 않다. 우리는 랫트 복막에서 정량적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 이용하여 miRNA를 정제하고 정량화하는 효과적이고 신뢰성있는 방법을 개발했다. 이 프로토콜은 4 단계로 구성되어 있습니다 : 1) 복막 샘플의 정화; 2) 복막 막 시료로부터의 miRNA를 포함하는 전체 RNA의 정제; 3) cDNA를 생산하기위한 miRNA의 역전사; 및 4) miRNA 발현을 검출하기위한 qRT-PCR. 이 프로토콜을 사용하여 6 개의 miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 및 miRNA-34a-5p)의 발현이 증가한 것을 성공적으로 확인했습니다.쥐 복막 섬유증 모델의 복막이 대조군에 비해 유의하게 높았다. 이 프로토콜은 많은 병리학 조건에서 쥐의 복막에서 miRNA 표현의 프로필을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 결과는 이전에보고 된 연구 8 에 근거합니다. 우리는 복막 섬유증에서 miRNA 발현 프로파일을 조사했다. 복막 섬유증은 복막 투석의 주요 합병증입니다. 그것은 mesothelial 세포 monolayer의 손실과 extracellular 매트릭스 구성 요소의 과도한 축적을 특징으로하고, 복막 막 실패 14 , 15 와 관련이 있습니다....

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Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

여기 우리는 양적 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 쥐 복막에서 microRNA 표현의 탐지 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 병리학 적 조건에서 쥐 복막에서 microRNA 발현 프로파일을 연구하는데 적합합니다.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...