Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

这项工作是由来自美国国立卫生研究院（F32 NS059120到RLM和R01NS25217和P30NS048154到ABR）的资助。

（;实验动物资源处安舒茨科罗拉多大学医学校园IACUC）所有动物的程序是由机构动物护理和使用委员会的批准。 1.斑马鱼的饲养<ol><li>提高，并在28.5℃下在10小时黑暗/ 14小时光照循环，并用适当的水处理和交换52保持成年斑马鱼鱼（Danio rerio）。 </li><li>提高斑马鱼胚胎/幼虫在28.5℃下在胚胎培养基，直到它们达到所要求的阶段（ 例如，2 DPF）?...

这里描述的方法允许脊髓的最小解剖后斑马鱼胚胎的感觉和运动神经元的电和形态学特征。神经元至少1小时，强加给这些录音时间限制保持健康。神经元已经使用标准的全细胞构型记录，以及从核贴剂;后者的方法最小化，可以排除离子电流9的详细研究生物物理空间钳的问题。 一个重要的挑战是实现胚胎或幼虫室的坚定执着，以去除皮肤和执行提供访问感?...

<html>乔治·斯特雷伊辛格率先使用斑马鱼 ，俗称斑马鱼作为脊椎动物发育10的遗传分析模型系统。该模型提供了几个优点，包括：（1）相对简单和便宜畜牧业; （2）外部受精，从而允许方便地从最早的发育阶段的胚胎;和（3）的透明胚胎，从而允许细胞，组织和器官的直接和重复观察，因为它们形成。 在随后的几十年里，进行了若干改进进一步增加了斑马鱼模型的力量。特别是，正向遗传学屏幕和全基因组测序工作发挥了重要作用的基因突变和基因关键的标识许多发育过程11，12，13，14，“&gt; 15，16。Gateway克隆方法已经允许转基因的常规应用方法17,18。在基因组编辑的最新进展，通过转录激活状（TALEN的）中列举和群集规则间隔开的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9核酸酶，允许有针对性地引入突变，以及敲除和敲入接近19，20，21，22，组合，这些方法使斑马鱼为底层的具体行为和一些人类疾病的遗传机制的研究提供强大的模型23，24，25，26，27。 今年工作重点放在发展心理调节和电活动的神经发育中的作用。重点是脊髓，为此，斑马鱼模型提供了几个优点。首先，它是相对容易的，在胚胎和幼体阶段访问斑马鱼;因此，可以在具有较少的神经元和较简单的电路28，29的发育阶段研究脊髓功能。此外，斑马鱼脊髓具有一组不同的神经元，类似于其他脊椎动物中，因子30，31，32，33，34，35所证明由转录的特性和特征图案。 旨在揭示背后脊髓电路的功能的机制的多数在斑马鱼的研究中，尤其是支持运动的，是可以理解集中于幼虫阶段36，37，38，39，40，41，42，43。然而，许多形成脊柱机车网络中的神经元的启动它们的分化在早期胚胎阶段，〜9-10小时后受精（HPF）44，45，46，47，48，49，50，51。鉴于此，了解如何脊髓神经元的形态学和电学性质发生和胚胎和幼虫阶段之间的变化是一个重要overa的运动电路形成和功能LL理解。 这里描述的解剖方法允许从脊髓神经元膜片钳记录，并在胚胎阶段（〜17-48 HPF）和幼体阶段（〜3-7天受精后[DPF]）得到成功应用。该方法限制了解剖，以提供对感兴趣的神经元所需要的量。所述协议从多数的其它公开的方法的不同之从在兽医缝合胶斑马鱼脊髓神经元的记录使用的，而不是一个细钨针，胚胎或幼虫附着到记录室。的两种不同的方法的可用性（ 即，缝合胶相对于钨针）用于安装所述斑马鱼的胚胎或幼虫用于电生理分析为研究人员提供替代方案，以实现其特定的实验目标。 首先，从弹出访问和记录过程<html>初级感觉神经元的ulation，Rohon-胡子细胞，进行了描述。这些神经元的细胞体位于背侧脊髓内。 Rohon-胡子细胞存在于许多脊椎动物物种，在开发早期分化，和背后胚胎触摸响应6，44，47，48。 第二，用于访问和从脊髓运动神经元的记录程序的详细。期间神经发生的两个波斑马鱼脊髓运动神经元引起的。在出生较早初级运动神经元出现在原肠胚形成（〜9-16 HPF）的端部，只有3-4本每hemisegment 45,46，49初级运动神经元。相反，次级运动神经元的后出生人口是比较多，而且在长时间内产生，起始于14〜HPFEF“&gt; 45,50。在中间躯干段二级运动神经元起源主要是由51 HPF 50完成。二级运动神经元都被认为是运动神经元的羊膜对方46。有趣的是，脊椎神经元，经由多巴胺，调节运动在胚胎的幼虫和次级运动神经元起源和年轻幼虫50,51。初级和次级的运动神经元的每一个包括若干不同的亚型。每个初级运动神经元亚型的项目的外围轴突其支配的特性的肌肉群，从而导致刻板，识别轴突轨迹。通常，次级运动神经元遵循先前由初级运动神经元建立的轴索途径。因此，相对于轴突轨迹，原发性和继发性运动神经元是相似的，不同之处在于厚度轴突胞体和尺寸的重新更大初级运动神经元45。 三，讨论从几个类型的interneurons的记录方法。然而，在这些情况下，需要去除其它脊髓细胞的有限量的，因此，脊髓比从Rohon-胡子细胞或运动神经元的录音少完好无损。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

斑马鱼，首先介绍了作为一个发展模式，在许多领域都得到了普及。饲养迅速发展生物体的大数自如，与胚胎光学透明度结合，担任该模型的初始吸引力属性。在过去的二十年里，这种模式的成功得到了进一步的顺从大规模诱变筛选，并通过易于转基因的推动。最近，基因编辑方法扩展了模型的力量。 对于神经发育研究，斑马鱼胚胎和幼虫提供到可应用多种方法的模型。在这里，我们专注于让神经元，电兴奋性的本质属性的研究方法。我们对斑马鱼的脊髓神经元的电生理研究编制涉及使用兽医缝合的胶水，以确保准备录音室。记录替代方法从斑马鱼胚胎和幼虫涉及使用细钨针1，2，3，4，5的制备腔室的连接。钨销是最经常用于安装在横向取向的制备中，虽然它已被用于安装幼虫背的一面朝上4。缝合胶水已被用于安装在两个方向的胚胎和幼虫。使用胶水，一个最小的夹层可以执行，允许访问脊髓神经元而不使用酶处理的，从而避免了任何所得的损坏。然而，对于幼虫，有必要施加一个简短酶处理以除去脊髓周围的肌肉组织。这里所描述的方法已被用来在几个developmenta研究运动神经元的interneurons和感觉神经元的内在电性能升级6，7，8，9。

（ 图5A和5B），我们已经成功地从Rohon胡子神经元记录在17个HPF胚胎到7 DPF幼虫。当Rohon-胡子细胞记录，将制备物固定背的一面朝上。这种安装允许基于它们的表面背的位置和大胞体大小Rohon-胡子细胞的明确识别。识别另外由这些神经元的超极化的定型静息膜电位（ 图5， 小图表 ）6，54</su...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

这手稿描述了从斑马鱼胚胎和幼虫的脊髓神经元的电生理记录的方法。制备维持神经元在原地 ，往往涉及到最小的清扫。这些方法允许对多种脊髓神经元的电生理学研究中，从通过早期幼体阶段的初始电兴奋采集。

斑马鱼<em&gt;原位</em&gt;脊髓制备用于脊髓感觉和运动神经元的电生理记录

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

从胚胎脊髓​​连合神经的解剖和文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

科研

神经科学

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

DII的标签DRG神经元的研究轴突分支在小鼠胚胎脊髓整装准备

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

在斑马鱼幼虫脊髓横断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

斜脊髓切片用于神经前根刺激的制备

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

第一次混合胶质细胞培养的成年小鼠脊髓组织准备

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

脊髓神经元从新生小鼠中分离和培养

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

从产前Islmn：GFP转基因小鼠的奥库罗运动、特罗赫利尔和脊柱运动神经元的分离与培养

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

TDP-43在斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中的光遗传学相变

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...