Name: zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (F32 NS059120 til RLM og R01NS25217 og P30NS048154 til ABR).

Alle procedurer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz Medical Campus). 1. zebrafisk Husbandry <ol><li> Hæve og opretholde voksen zebrafisk (Danio rerio) ved 28,5 ° C på et 10 timer mørk / 14 timers lys cyklus og med passende vandbehandling og udveksling 52. </li><li> Hæv zebrafisk embryoner / larver ved 28,5 ° C i embryo medium, indtil de når den ø...

De her beskrevne metoder giver mulighed for elektrisk og morfologiske karakterisering af sensoriske og motoriske neuroner i zebrafisk embryoner efter minimal dissektion af rygmarven. Neuroner forblive sunde i mindst 1 time, den frist, der er pålagt disse optagelser. Neuroner er blevet optaget ved hjælp af standard helcellekonfigurationen, samt fra kerneholdige plastre; sidstnævnte metode minimerer rum-clamp problemer, der kan udelukke en detaljeret biofysisk undersøgelse af ionstrømme 9. </p...

<html> George Streisinger banebrydende anvendelse af Danio rerio, almindeligvis kendt som zebrafisk, som modelsystem til genetisk analyse af hvirveldyr udvikling 10. Modellen giver flere fordele, herunder: (1) relativt simple og billige husdyrhold; (2) ekstern befrugtning, der giver nem adgang til embryoner fra de tidligste udviklingsstadier; og (3) en transparent embryo, hvilket tillader direkte og gentagne observationer af celler, væv og organer som de dannes. I løbet af de følgende årtier, flere fremskridt yderligere øget magt zebrafisk model. Især forward genetiske skærme og hel-genom sekventering af indsatsen spillet en nøglerolle i identifikationen af mutationer og gener er kritiske for mange udviklingsmæssige processer 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16. Gateway kloningsmetoder har tilladt rutinemæssig anvendelse af transgene nærmer 17, 18. Nylige fremskridt i genom redigering, eksemplificeret ved transkriptionsaktivator-lignende (Talens) og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) -Cas9 nukleaser, muliggøre målrettet indførelse af mutationer, samt knock-out og knock-in nærmer 19, 20, 21, 22. kombinerede, disse metoder gør zebrafisk en kraftfuld model til undersøgelse af de genetiske mekanismer bag specifikke adfærd og flere humane sygdomme 23, 24, 25, 26, 27. Dette arbejde fokuserer på at udviklemental regulering og den rolle, elektriske aktivitet i neuronal udvikling. Fokus er på rygmarven, som den zebrafisk model giver flere fordele. Det første er det relativt let at få adgang til zebrafisk på embryonale og larvestadier; derfor kan man studere rygmarv funktion under udviklingsstadier, der har færre neuroner og enklere kredsløb 28, 29. Desuden zebrafisk rygmarv har et bredt sæt af neuroner, der ligner andre hvirveldyr, som demonstreret ved karakteristiske og karakteristiske mønstre af transskriptionsfaktorerne 30, 31, 32, 33, 34, 35. De fleste undersøgelser i zebrafisk, der sigter mod at afdække de mekanismer, der ligger til grund for funktionen af ​​rygmarv kredsløb, isærdem, der understøtter bevægelse, forståeligt nok fokuseret på larvestadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Men mange af de neuroner, der danner spinal lokomotiv net indlede deres differentiering på tidlige embryoniske stadier, -9-10 timer efter befrugtning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. I lyset af dette, at forstå, hvordan de morfologiske og elektriske egenskaber af spinale neuroner opstår og skift mellem de embryonale og larvestadier er vigtigt for en Overall forståelse af lokomotorisk kredsløb dannelse og funktion. Dissektion fremgangsmåder beskrevet her tillader patch clamp optagelser fra spinale neuroner og er blevet anvendt med succes på fosterstadiet (~ 17-48 HPF) og larvestadier (~ 3-7 dage efter befrugtning [dpf]). Denne tilgang begrænser mængden af ​​dissektion forpligtet til at give adgang til de neuroner af interesse. Protokollen afviger fra størstedelen af ​​de andre publicerede metoder til optagelse fra zebrafisk spinale neuroner i at dyrlæge sutur lim anvendes, snarere end en fin wolfram stift, at fastgøre embryo eller larve til registreringskammeret. Tilgængeligheden af to forskellige fremgangsmåder (dvs. sutur lim versus wolfram pin) til montering af zebrafiskembryoer eller larver til elektrofysiologisk analyse giver forskere med alternative muligheder for at nå deres specifikke eksperimentelle mål. Først, procedurer for adgang til og optagelse fra en pop<html> ulering af primære sensoriske neuroner, Rohon-Beard celler, er beskrevet. Cellen organer disse neuroner ligger inden for dorsale rygmarven. Eksisterer Rohon-Beard celler i talrige arter af hvirveldyr, differentiere tidligt i udviklingen, og ligger til grund for den embryoniske anslagsfølsomt 6, 44, 47, 48. For det andet, procedurer for adgang til og optagelse fra spinale motoriske neuroner er detaljeret. Zebrafisk spinale motorneuroner opstå under to bølger af neurogenese. De tidligere fødte primære motoriske neuroner opstår i slutningen af gastrulation (~ 9-16 HPF), med kun 3-4 primær motorneuroner stede pr hemisegment 45, 46, 49. I modsætning hertil senere fødte population af sekundære motoriske neuroner er mere talrige og opstår under en længere periode, der starter ved ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. Sekundær motorneuroner genese i midten af centrallinjesegmenter er hovedsagelig afsluttet ved 51 HPF 50. Sekundære motorneuroner anses for at være modstykket motoriske neuroner i amniotes 46. Interessant supraspinale neuroner via dopamin, regulere bevægelse i larve og sekundære motorneuroner genese i embryoet og unge larve 50, 51. primære og sekundære motoriske neuroner hver omfatte adskillige forskellige undertyper. hver primær motor neuron undertype projekter en perifer axon der innerverer en karakteristisk muskel gruppe, hvilket resulterer i en stereotyp, identificere axonal bane. Generelt sekundære motorneuroner følger de axonale pathways tidligere fastsatte af primære motoriske neuroner. således med hensyn til axonale baner, primære og sekundære motorneuroner er ens, med den undtagelse, at axonal tykkelse og somato størrelse enre større for primære motorneuroner 45. For det tredje er metoder til optagelse fra et par typer af interneuroner diskuteret. Men i disse tilfælde er en begrænset mængde af fjernelse af andre rygmarv celler kræves, og dermed rygmarven er mindre intakt end for optagelser fra Rohon-Beard celler eller motorneuroner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter 0.2 mm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-bugarotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>11032-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4368-28-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-549 hydrazine salt</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>8161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>184</td>
			<td>silicone elastomer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>1-000-1000-100</td>
			<td>inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature barbed polypropylene fitting&#160;</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>6365-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive&#160;</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>&#160;Model P-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator&#160;&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon tubing</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-169-1B</td>
			<td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1-HC-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmaseal Three-Way Stopcocks&#160;</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>K75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioskop2 FS plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x/0.80w Achroplan objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition and analysis software&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td colspan="2">PClamp 10 - Clampex and Clampfit&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dissection and Recording Solutions(in mM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 - 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20&#176;C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" rowspan="1">Dissection/Ringer&#8217;s solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pipette (intracellular) recording solution</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Alexa-594 hydrazine salt stock solution.&#160;</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 &#181;l) and store at -20&#176;C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution&#160; with a centrifuge tube filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilizing agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;M &#945;-bungarotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 250 &#956;M stock in ddH2O (1 mg/500 &#956;l), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM Tetrodotoxin</td>
			<td></td>
			<td colspan="2">Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 &#181;l aliquots, and sotre at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish in situ spinal cord preparation for electrophysiological recordings from spinal sensory and motor neurons

Zebrafisk, først introduceret som en udviklingsmæssig model, har vundet popularitet i mange andre områder. Den lette opdræt stort antal hurtigt udvikle organismer, kombineret med den embryonale optisk klarhed, tjente som indledende overbevisende attributter i denne model. I løbet af de seneste to årtier har succesen af ​​denne model blevet yderligere fremdrives ved sin modtagelighed for store mutagenese skærme og ved den lethed transgenese. På det seneste har gen-redigering tilgange udvidet magt modellen. For neurologiske undersøgelser, zebrafisk embryo og larve som model til hvilken flere metoder kan anvendes. Her vil vi fokusere på metoder, der tillader undersøgelse af en væsentlig egenskab af neuroner, elektrisk ophidselse. Vores forberedelse til elektrofysiologisk undersøgelse af zebrafisk spinale neuroner involverer anvendelsen af ​​dyrlæge sutur lim for at fastgøre præparatet til et registreringskammer. Alternative metoder til registreringfra zebrafisk embryoner og larver involverer fastgørelsen af præparatet til kammeret ved hjælp af en fin wolfram ben 1, 2, 3, 4, 5. En wolfram stift er oftest anvendes til at montere præparat i en lateral orientering, selv om det har været anvendt til at montere larver dorsale opad 4. Suturen limen er blevet anvendt til at montere embryoner og larver i begge orienteringer. Ved hjælp af lim, kan en minimal dissektion udføres, giver adgang til spinale neuroner uden anvendelse af en enzymatisk behandling, hvorved der undgås skade medføre. Men for larver, er det nødvendigt at anvende en kort enzymbehandlingen til fjernelse af muskel væv, der omgiver rygmarven. De her beskrevne metoder er blevet anvendt til at undersøge de iboende elektriske egenskaber af motoriske neuroner, interneuroner og sensoriske neuroner i flere developmental stages 6, 7, 8, 9.

Vi har med succes optaget fra Rohon-Beard neuroner i 17 HPF embryoner gennem 7 dpf larver (figur 5A og 5B). Når blev registreret Rohon-Beard celler blev præparatet monteret dorsale opad. Sådan montering giver mulighed for utvetydig identifikation af Rohon-Beard celler baseret på deres overfladiske dorsale positioner og store soma størrelser. Identifikationen er yderligere bekræftet af den stereotype hyperpolariserede hvilemembranpotentiale af disse...

Watch this Scientific Journal Video about Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons at JoVE.com

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dette manuskript beskriver metoder til elektrofysiologiske optagelser fra spinal neuroner i zebrafisk embryoner og larver. Præparatet fastholder neuroner in situ og ofte indebærer minimal dissektion. Disse fremgangsmåder tillader den elektrofysiologiske undersøgelse af en række spinale neuroner, fra den oprindelige erhvervelse elektrisk ophidselse gennem de tidlige larvestadier.

Zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Forberedelse til Elektrofysiologiske Optagelser fra Spinal sensoriske og motoriske neuroner

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Dii-mærkning af DRG-neuroner til Study aksonal Forgrening i en hel Mount Udarbejdelse af Mouse Embryonale Spinal Cord

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transection i larvestadiet zebrafisk

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Udarbejdelsen af ​​Oblique Spinal Cord Skiver for ventrale Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolation og Culture fra Neonatal Mus

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Forberedelse af akut rygmarven skiver til hele-celle Patch-klemme optagelse i Substantia Gelatinosa neuroner

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Isolation og kultur af oculomotor, Trochlear, og spinal motor neuroner fra prænatal ISLMN: gfp Transgene mus

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Optogenetisk fase overgang af TDP-43 i Spinal Motor Neuroner af Zebrafish Larver

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...